p16基因缺失在成人Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病中的临床意义

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探讨p16基因缺失在成人Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph+ ALL）中的临床意义。

回顾性分析80例Ph+ALL伴p16基因缺失患者的临床特征、免疫表型、细胞遗传学、分子生物学改变及其预后。

31.3% Ph+ALL患者合并p16基因缺失；p16基因缺失组与非缺失组相比，初诊时高白细胞计数（WBC≥30×109/L）更常见，高表达CD20，更易出现附加染色体异常，其中以累及7、8、19号染色体以及der（22）较为常见；两组诱导缓解率比较差异无统计学意义（P=0.033），p16基因缺失组患者治疗3个疗程后获BCR-ABL融合基因主要分子学反应（MMR）率和完全分子学反应（CMR）率均明显低于非缺失组（P值分别为0.034和0.036），且复发率明显高于非缺失组（P=0.033）；p16基因缺失组使用伊马替尼联合化疗者和使用达沙替尼联合化疗者的MMR、CMR率及复发率差异均无统计学意义（P值均>0.05）；p16基因缺失组患者3年总体生存（OS）率及无病生存（DFS）率分别为37.1%和12.4%，显著低于非缺失组的54.1%和45.9%（P值分别为0.037和0.026）；25例p16基因缺失患者中14例行异基因造血干细胞移植（allo-HSCT），其中位OS时间为21个月，明显长于非移植组患者的12个月（P=0.030）。

成人Ph+ALL伴p16基因缺失患者预后相对较差，二代酪氨酸激酶抑制剂不能明显改善其疗效，但allo-HSCT能够改善部分患者的生存，明确p16基因缺失状态对于评估预后和指导临床治疗有重要意义。

To investigate the clinical implications of p16 gene deletion in adult Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia (Ph+ ALL).

Retrospective analysis of clinical, immunophenotypic, cytogenetics, molecular characteristics and prognosis of 80 newly diagnosed Ph+ ALL patients with p16 deletion.

Of 80 adult Ph+ ALL, the prevalence of p16 gene deletion was 31.3%. p16 gene deletion carriers frequently accompanied with high WBC counts (WBC≥30×109/L) and CD20 expression. The incidence of complex chromosome abnormality in p16 gene deletion group was higher than that in non-deletion group, with alternations in chromosome 7, 8, 19 and der (22) more frequently observed. There was no difference occurred between patients with or without p16 gene deletion in complete remission (CR) rate following induction chemotherapy combined with tyrosine kinase inhibitors (TKIs). However, after three cycles of chemotherapy, the MMR and CMR rate in the p16 gene deletion group was lower than patients with wild-type p16 gene (P=0.034, P=0.036). The p16 gene deletion patients showed no significant differences in MMR, CMR and relapse rate between Imatinib or Dasatinib plus chemotherapy (P>0.05). Deletion of p16 gene was significantly associated with poor outcomes including worse overall survival (OS) (37.1% vs 54.1%, P=0.037), lower disease free-survival (DFS) (12.4% vs 45.9%, P=0.026), and increased cumulative incidence of relapse (P=0.033). Among the 25 patients with p16 deletion, 14 underwent allo-HSCT and the median survival was 21 months, better than that of patients received chemotherapy alone (12 months) (P=0.030).

This study indicated that deletion of p16 was associated with poor prognosis in adult Ph+ ALL, and the utility of second-generation TKI (Dasatinib) does not necessarily have an edge on efficacy over Imatinib, but allo-HSCT has the potential of elongating life expectancy. It is an important significance to define the status of p16 in Ph+ ALL for predicting prognosis and guiding therapy decision-making.

Ph染色体是急性淋巴细胞白血病（ALL）常见的细胞遗传学异常，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）联合化疗及异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）可显著改善Ph+ALL的预后，但是仍有部分患者出现耐药、复发甚至疾病进展[1]。TKI耐药仍是目前Ph+ALL治疗的一大难点，因此，探讨TKI耐药机制以及寻找新的预后标志对于该部分患者显得尤其重要。染色体9p21的异常在多种肿瘤的发生发展中起重要作用[2]。目前已经发现在9p21区域有CDKN2A（p16）和CDKN2B（p15）两个重要的抑癌基因，它们分别编码p16（INK4a）/p14（ARF）和p15（INK4b）周期蛋白，构成了一个重要的抑癌基因簇[3]。在ALL中，18.2%~45.0%的患者可以检测到p16基因缺失，我们前期研究及目前文献报道p16基因缺失可能是ALL预后不良的独立危险因素[4]–[5]。本研究中我们应用FISH技术检测80例初诊Ph+ALL患者p16基因缺失情况，并进一步分析该基因缺失与Ph+ALL患者临床特征、疗效及预后关系。

1．病例资料：对2010年1月至2015年4月就诊于我院血液科的80例初诊Ph+ALL患者的临床资料进行回顾性分析，所有患者均根据临床表现、骨髓细胞形态学、免疫分型、细胞遗传学及分子生物学结果进行诊断，符合WHO（2008）急性白血病诊断标准。骨髓细胞核型分析采用常规G显带法。骨髓细胞免疫表型分析采用流式细胞术检测淋系和髓系抗原。BCR-ABL mRNA检测采用常规实时荧光定量PCR（RQ-PCR）方法，以ABL作为内参基因，BCR-ABL mRNA水平以BCR-ABL/ABL基因转录本拷贝数×100%表示，敏感度为MR4.5（BCR-ABLIS=0.0032%）[6]。

2． FISH法检测p16基因缺失：针对p16基因缺失的预包被式探针诊断系统购于英国Cytocell公司，按设计组合标记固定于一张检测玻片，按试剂盒说明书进行操作。探针组包括：覆盖9p21区域101 kb的红色探针，9号染色体质控探针（D923，9q12上的异染色质块，绿色）。正常细胞的荧光原位杂交信号为2红2绿，1红2绿表明p16基因从1条染色体中缺失，即杂合性缺失，0红2绿为纯合性缺失（图1）。杂合性缺失与纯合性缺失均定义为缺失。根据ISCN（2005）标准分析检测结果，每份间期核标本计数200个细胞[7]。

A：正常细胞；B：杂合性缺失；C：纯合性缺失

3．治疗方案：所有Ph+ALL患者均首先予VILP（长春新碱、去甲氧柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、泼尼松）或VDLP（长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、泼尼松）方案进行诱导化疗，明确诊断后尽早联合TKI药物治疗（伊马替尼400 mg每日1次或达沙替尼100 mg每日1次）。诱导缓解后予Hyper CVAD-A（环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、地塞米松）方案和Hyper CVAD-B（大剂量甲氨蝶呤和阿糖胞苷）方案交替巩固治疗。其中54例患者在巩固化疗2~5个疗程后进行allo-HSCT。对所有患者均进行腰椎穿刺并鞘内注射药物（阿糖胞苷+甲氨蝶呤+地塞米松）预防中枢神经系统白血病。

4．疗效评估：首疗程诱导治疗结束后行骨髓细胞形态学检查，评价血液学缓解情况；3个疗程后疗效评价主要根据细胞分子学反应。完全缓解（CR）定义为化疗后患者骨髓中原始细胞≤0.050，外周血中性粒细胞绝对计数≥1.5×109/L，PLT≥100×109/L，白细胞分类中无白血病细胞，无髓外白血病。主要分子学反应（MMR）定义为BCR-ABL mRNA较治疗前下降至少3个对数级（BCR-ABL/ABL≤0.1%）。完全分子学反应（CMR）定义为BCR-ABL mRNA拷贝数低于检测极限水平（BCR-ABL/ABL≤0.0032%）[6],[8]。复发定义为获得CR患者骨髓中原始细胞≥0.050或者发生髓外侵犯。总生存（OS）时间指从诊断起至患者死亡（包括任何原因）或末次随访日止。无病生存（DFS）时间定义为自CR至白血病复发或在CR期间死亡或末次随访日。随访截止日期为2016年5月4日。

5．统计学处理：应用SPSS 20.0统计学软件进行分析，样本均数的比较采用t检验，率的比较采用卡方检验，生存率的比较采用Log-rank检验，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。P0.05）。p16基因缺失患者初发高白细胞（WBC≥30×109/L）比非缺失组更常见（P=0.042）（表1）。在p16基因缺失组中，除外2例核型分析失败的患者，余23例中18例（78.3%）初诊核型分析存在Ph染色体伴附加染色体异常，发生率较非缺失组高（P=0.035），其中以累及7号染色体（4例，3例−7，1例7q−）、8号染色体（4例，3例易位）、19号染色体（3例，2例−19，1例+19）和der（22）（4例）更为常见。此外，本组病例中发现的Ph染色体变异型易位有t（8;9;22）（q21;q34;q11）、t（4;9;22）（q21;q34;q11）、t（9;9;22）（q22;p24;q11）。

注：检验值中a为t值，余均为χ2值

2．伴p16基因缺失Ph+ALL免疫表型分析：对80例成人Ph+ALL患者骨髓细胞进行免疫表型分析，CD抗原表达>20%为阳性。p16基因缺失与未缺失组相比，除CD20外，两组间CD45、CD13、CD14、CD15、CD117、CD33、CD34、CD38、HLA-DR、CD10、CD19、CD22、CD2、CD3、CD7、CD11b、CD56等表达差异均无统计学意义（P值均>0.05），p16基因缺失患者多合并CD20表达（P=0.033）。

3．伴p16基因缺失Ph+ALL疗效分析：p16基因缺失组使用VDLP诱导方案14例，VILP诱导方案11例，非缺失组分别为37例和18例，两组差异无统计学意义（P=0.331）。p16基因缺失组与非缺失组患者化疗联合伊马替尼治疗分别为13例和29例，联合达沙替尼治疗分别为12例和26例，两组差异无统计学意义（P=0.952）。p16基因缺失组与非缺失组相比，首疗程诱导治疗CR率差异无统计学意义（84.0%对92.7%，P=0.249）。p16基因缺失组治疗3个疗程后MMR率为16.0%，CMR率为8.0%，显著低于非缺失组的40.0%和29.1%（P值分别为0.034和0.036）（表1）。两组患者BCR-ABL转录本均以P190为主，p16基因缺失组中P190阳性19例，p210阳性6例，非缺失组分别为40例和15例，差异无统计学意义（P=0.758）。p16基因缺失组中15例（60.0%）患者出现复发（血液学或中枢神经系统复发），复发率明显高于非缺失组（34.5%，P=0.033）。p16基因缺失组患者中化疗联合伊马替尼治疗13例，联合达沙替尼治疗12例，两者的MMR（15.4%对16.7%，P=0.930）、CMR率（7.7%对8.3%，P=0.953）及复发率（61.5%对58.3%，P=0.870）差异均无统计学意义。

4．伴p16基因缺失Ph+ALL患者生存分析：80例成人Ph+ALL患者中54例在巩固化疗2~5个疗程后进行allo-HSCT，其中p16基因缺失组14例，非缺失组40例，截至末次随访，80例患者中位随访时间为19.5（2~79）个月。p16基因缺失组和非缺失组患者中位生存时间分别为18和47个月（P=0.037）。p16基因缺失组患者3年OS率及DFS率分别为37.1%、12.4%，而非缺失组分别为54.1%、45.9%，差异均有统计学意义（P值分别为0.026和0.030）（图2、3）。p16基因缺失患者中移植组中位生存时间为21个月，非移植组为12个月（P=0.030）（图4）。

2014年NCCN指南中将ALL分为高危组和标危组，定义高危组ALL的危险因素有：①Ph阳性或BCR-ABL基因阳性；②t（v;11q23）或MLL基因重排；③诊断时WBC≥30×109/L（B-ALL），≥100×109/L（T-ALL）；④低二倍体（染色体数