原核表达载体

本文主要讨论原核表达载体的选择与优缺点，如pet系列，型号从小到大，种类多样，往往让新手选择起来不知所措。所以和大家讨论他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。

pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。  pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

①是原核蛋白表达引用最多的系统

②在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低

③真正的调节表达水平的“变阻器”控制

④提供各种不同融合标签和表达系统配置

⑤可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌

⑥许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物

⑦许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化

阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初开发的 T7 启动子驱动系统， pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

1）控制基础表达水平

pET 系统提供 6 种载体 – 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

2）宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌( λ DE3 溶原菌)中表达目标蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 λ DE3 溶原菌。

有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA – 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。这些菌株可稳定表达其产物可能导致 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。

3）高严紧性 T7 lac 启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制(除了抑制 lacUV5 )。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。

4）控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物( IPTG )浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。

所有的 pET 载体均来自 pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体(包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 )表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。(注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分)

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。

1）选择要点

选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

①表达蛋白的用途

②表达蛋白的已知信息

③克隆策略

pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC (连接非依赖的克隆)策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。 LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

2）溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 –Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导( 15 -25 ° C )也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭 ( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b ( + )载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

3）满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽(融合序列很小)，它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。

使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的 FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭(特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b ( + )和 35b ( + ))。因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。

各种融合标签和相应 pET 载体见列表。一些 pET 载体带有数个***的融合标签，作为 5′ 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5′ 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点(凝血酶、因子 Xa 和肠激酶)的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC 载体 Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。

所有 pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

( DE3 )指宿主为 λ DE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶(为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物)的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami ( DE3 )表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta ( DE3 ) pLysS 和 Rosetta ( DE3 ) pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。

Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶( lacY )突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整 IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平(通常与 pET 载体相关)。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner ( DE3 ) pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。

原核表达系统中，哪种载体最好 ?

原核表达没有最好，可以说一般都是在碰，

和你要表达蛋白的性质有关，也和你表达后的用途，及因此而选择的表达策略有关。

比如，

1.你是否介意有亲和标签，亲和纯化当然纯化相对容易，但有时亲和标签的存在会影响蛋白的功能，

2.如果用亲和标签，用什么亲和纯化策略，his 或GSH还是染料抑或是IgG-ProteinA亲和，LAB的IMPAC-TWIN,还是别的如转铁蛋白等，亲和层析的策略也有很多，

3.最终产物是否有必要将亲和标签去掉，如用蛋白酶切掉标签，或 IMPAC-TWIN会自己切掉，用因子X切掉HIS,

4.表达的部位，是可溶性表达还是包涵体表达，是周质表达还是分泌表达还是分泌表达。

5.是否加入开关诱导、或是加入IPTG诱导噬菌体T7系统。

6.你表达的蛋白质是否会与细菌内某些蛋白相互作用而致表达失败。

7.如果不用亲和标签，蛋白纯化用什么方法纯化?

8.即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。

9.载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度 等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。

10.蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。

这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。

原核表达系统中，哪种载体最好 ?

载体没有最好，看哪一种最合适你的实验目的。

这几年新发展的载体一般具有下列特点的一个或多个：

1)更多的融合标签选择(提供多种亲和纯化方便)

2)严紧的表达调控，更低的渗漏表达

3)分子伴侣蛋白，促进折叠和可溶性表达

此外，具有更好的质粒稳定性并能够纠正遗传密码偏爱的新的蛋白酶缺陷的宿主细胞也是一个很好的工具。

最新的不一定是最好的，pBV220经常可以给出不错的表达，虽然多半是包含体。

不同的载体的特点不同，主要的差别有启动子类型，质粒拷贝数等，基因本身的因素基因5’非编码区的二极结构，密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要(BL21是蛋白酶缺陷的菌株)，融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。现在还没有谁可以用大肠杆菌成功表达每一个基因，尤其是使用指定的表达系统更是不可能。根据研究的目的以及基因和载体的特点选择表达系统，说说容易，做起来很难。

SDS-PAGE所显示的不表达很多情况下是低表达，尤其是当目的蛋白迁移率与菌体中某种丰富蛋白一致时，不高的表达带常被遮盖。Western blotting的灵敏度高，可以用来检测很低的表达。

对于某些研究来说，表达是为了在细胞内提供某种功能，不需要高表达;更多的情况是把大肠杆菌作为制备重组蛋白的细胞工厂，此时表达量具有重要意义，低表达为蛋白纯化带来困难，对于某些研究或开发来说，低表达意义不大。 当然，通过western blotting检测可以排除一些基因表达中的不确定或待确定因素，而且某些时候即使是高表达，western blotting也是蛋白定性的重要指标。

因表达是基因工程的重要内容，是工业、医疗和基础研究领域的重要技术。

蛋白表达系统按照基因表达宿主的性质分为原核表达系统和真核表达系统两类，前者主要包括大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统等，后者主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。

原核表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后加工机制的缺乏，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠。

简单单细胞真核生物表达系统以酵母表达系统为代表，其中甲醇酵母具有较大优势(主要包括毕赤酵母和汉森酵母。甲醇酵母表达系统主要优点有：表达量高，表达可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，容易实现高密发酵等。缺点是并非所有基因都可以获得高表达，当然，这是几乎所有表达系统的共同问题。

哺乳动物细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，缺点是表达量通常较低，生产成本高。

表达系统选择的根据是研究和开发的目的。具体考虑以下几个方面：

目的基因的来源，如果是大肠杆菌来源的基因，选择大肠杆菌作为表达系统较好，这主要是考虑到与目的基因来源相同的宿主对于保证蛋白的活性较有利且基因遗传密码的偏爱性较一致。

生产的成本和工艺放大要求。大肠杆菌和毕赤酵母系统生产重组蛋白的成本低，生产工艺较简单，用于规模化生产较有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考虑目的蛋白的活性和小规模纯化制备的方便。

研究周期和可操作性。在这一点上，大肠杆菌优于酵母，酵母优于细胞。

蛋白的用途和用量。对于药品开发，这三种宿主都可以选择，但要考虑到报批的要求。如果是体内用，天然的氨基酸序列较重要，最好不要因为基因表达和蛋白纯化的便利引入融合伴侣，如果是制备抗原用于纯化和体外的活性研究则不必太严格。某些蛋白体内活性需要的剂量并不大，如angiostatin，但是，大肠杆菌或酵母表达的蛋白体内半衰期短，所以蛋白用量较大。

蛋白的天然性质。如果目的蛋白本身是分泌蛋白，则选择分泌表达较好，毕赤酵母分泌表达优势非常显著。对于大肠杆菌系统来说，其蛋白的分泌机制复杂，除了信号肽之外，有些蛋白的分泌和与成熟蛋白的序列有关，而且大肠杆菌的分泌很难进入培养基，通常是在周质空间积累。根据蛋白活性的要求，结合其天然的性质，选择表达系统是非常重要的。

知识产权的考虑。如果是研究工作，选择商品化的载体较好，因为同行对这些载体也很了解，对于用这些载体做出来的结果容易比较。如果是开发工作，选择表达系统时最好是把载体的知识产权问题考虑进去，否则可能会受制于人。

总之，选择一种合适的蛋白表达系统是开始基因表达工作前的重要步骤，选择的主要依据是研究的目的，结合各种其他参数的综合考虑。这种选择可以充分体现出研究者智慧和风格。

1)pThioHisA,B,C

Trc 启动子，Thioredoxin融合，IPTG诱导，也可以用NdeI进行非融合表达

2)pBV220

PLPR***启动子，42度热诱导，EcoRI克隆，非融合表达。

3)pET系列

T7启动子，IPTG诱导，一般为融合表达，NdeI或NcoI非融合表达

4)pQE系列载体

T5启动子,IPTG诱导，融合表达

返回：原核表达系统