酱油发酵中乳酸菌的功能及其研究进展

彭勃，侯莎，周其洋，童星*

(1.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 528000；2.佛山市海天(高明)调味食品有限公司,广东 佛山 528511；3.广东省调味食品生物发酵先进技术重点实验室，广东 佛山 528000)

酱油是人们日常生活中应用最广泛的发酵调味品之一，在生活水平不断提高的过程中，人们对酱油的品质需求也日益提高。酱油的种类较多且制作工艺比较复杂，主要涉及制曲、盐水发酵、压榨或提取以及杀菌等阶段[1]。在传统酱油的生产过程中，主要生产的菌株是米曲霉，而乳酸菌等其他菌株基本上来自制曲、发酵器皿或空气。在制曲阶段，部分乳酸菌能够与曲霉共同繁殖，而进入盐水发酵阶段，高盐体系抑制了大部分乳酸菌的生长，在此阶段能够继续繁殖并发挥功能的乳酸菌，无论是自然条件下引入还是人为添加，都必须具有能够在高渗透压下生长繁殖的特点。受技术水平的限制，自古以来酱油中的乳酸菌一直处于自然繁殖状态，随着研究的不断深入，如今酱油中乳酸菌的使用已经越来越具有功能性和精确性。

1907年首次报道了在发酵酱油醪中存在一些形成四分体的球菌，经过对四分体形成球菌的一系列研究，1958年将一组嗜盐乳酸球菌定为新种——酱油片球菌[2]，它很快被重新分类为嗜盐片球菌并在《伯杰氏系统细菌学手册》中以此名称被引用；1990 年，该物种被转移到一个新属并命名为嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilusi)[3]。

嗜盐四联球菌一直以来被认为是酱醪的优势种之一，在酱油制作过程中加入嗜盐四联球菌具有提升酱油风味、改善酱油品质的功能。根据酱油中微生物菌落种群研究发现，酱油发酵至第2周时就能够检测到嗜盐四联球菌，而在发酵后期的酱醪中含量较少[4-5]。从酱醪中分离得到的嗜盐四联球菌耐盐性很强，能够在18%的高盐环境下产生乳酸，通过转录组学测序和分析发现嗜盐四联球菌的ATP结合转运系统与其耐盐性呈正相关[6]。

魏斯氏菌(Weissella)属于耐盐型乳酸菌的一种，在发酵食品中用途广泛，最早被分类为副肠系膜明串珠菌(Leuconostocparamesenteroides)，1993 年分类修改为魏斯氏菌。该类菌株的环境耐受力很强，可在20 g/dL盐分下生长，pH耐受范围为3.0～9.5[7-8]。魏斯氏菌是参与酱油发酵过程中的优势菌属，在细菌总数中占比可达80%，能够将原料中的葡萄糖转化为乳酸，并产生特有的香气，使其口感更柔和浓厚、色泽红润，对酱油的发酵效果和风味具有显著的贡献，其中融合魏斯氏菌(W.confusa)、类肠膜魏斯氏菌(W.paramesenteroides)和食窦魏斯氏菌(W.cibaria)是最具优势的3个菌种[9]。

研究显示，从酱油中分离出的类肠膜魏斯氏菌能够分泌耐高盐的蛋白酶，食窦魏斯氏菌能够在高盐且pH较低的环境中产生较大量的富马酸，因此魏斯氏菌十分具有提高酱油中氨基酸含量以及有机酸丰富度的潜力。此外，部分魏斯氏菌还能对白色念珠菌等致病菌起到一定的抑制作用，是酱油中的一类功能型微生物[10]。

酱油发酵过程中还存在其他乳酸菌，例如：片球菌属(Pediococcus)在酱油乳酸菌中占有较大比重，主要包括乳酸片球菌(P.acidilactici) 和戊糖片球菌(P.pentosaceus)，其耐盐性较好且在发酵前期还参与有机酸及氨基酸代谢[11]；乳杆菌属(Lactobacillus)在自然界中分布广泛，包括多个种，在制曲阶段适量生长能够抑制有害物质的产生，其中发酵乳杆菌(L.fermentum)等在酱醪中可成为优势菌种[12]，但大多数乳杆菌的耐盐性较低，在酱醪中占比较小，从发酵起始阶段含量逐渐降低。乳球菌属(Lactococcus)是1985年Schleifer等提议设立的一个新菌属[13]，也少量存在于酱油醪中，部分乳酸乳球菌(L.lactis)及其亚种能产生乳链菌肽，在食品中具有天然的抑菌功能[14]。

制曲是传统发酵制品如酱油、豆豉等的关键工序，传统酱油采用米曲霉制曲，米曲霉在原料中生长繁殖，形成丰富的酶系，包括中性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等[15]。在传统酱油半开放的生产过程中，实际参与到制曲过程中与米曲霉共同完成降解、转化及代谢过程的微生物种类较多。制曲阶段的乳酸菌通常以非耐盐性乳酸菌为主，但目前为止对于曲料中乳酸菌作用的研究相对较少。

钟方权等[16]从酱油中筛选到一株非耐盐乳酸菌耐久肠球菌(Enterococusdurans)，能够显著影响曲料中酶系的丰富度和酶活力，并确定了其最佳接种比例为米曲霉接种量0.4%、乳酸菌接种量1.0%。米曲霉和乳酸菌的共同使用可显著提高小麦曲料的中性、酸性蛋白酶活力，提高全氮、氨基酸态氮和谷氨酸含量，能够有效增强酱油的鲜味[17]。孙莉等[18]在酱油制曲时加入非耐盐的融合魏斯氏菌，使酱油中的酚类物质显著增加，提高了抗氧化活性，同时增加了风味物质和氨基酸含量，显著改善了酱油的风味。

除了直接提升酱油的品质外，制曲过程中使用乳酸菌还能够抑制曲料中杂菌的繁殖，或减少有害物质的含量。在日本酱油生产过程中，常用温度控制法提高制曲前期的乳酸菌生长活性，生成少量乳酸，抑制其他杂菌的生长，再逐渐升高温度，使乳酸菌不至于过度消耗营养物质而影响曲霉的生长。大豆在制曲过程中有污染黄曲霉毒素风险，将嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)的菌体和代谢产物作用于曲料中，能够显著抑制黄曲霉毒素的产生，同时不影响米曲霉的生长[19-20]。

当酱油进入盐水发酵阶段，米曲霉逐渐死亡，耐盐的乳酸菌、酵母菌等愈发活跃，发挥其各自的作用，这些微生物的演替、代谢与酱油的风味特征和产量密切相关[21]。酱油中的乳酸菌经过长时间的驯化都属于耐盐或嗜盐性菌种，但往往耐酸性不强，在盐水发酵过程中，乳酸菌通过产生乳酸使pH值降至5.0以下后，自身无法继续生长，而酱油中发挥主要作用的鲁氏酵母(Saccharomycesrouxii)则适宜在pH 5.5以下生长。此外，在发酵初期乳酸菌的代谢活动可以促进原料水解，产生更多的还原糖，也为酵母的快速生长提供了有利条件[22]。由此，酱油酿造过程中加入耐盐乳酸菌能够在一定程度上促进酵母菌的发酵效果，从而间接改善酱油的发酵效果。

刘卓[23]研究证明，在高盐稀态酱油中，耐盐乳酸菌与球拟酵母(Torulopsis)能够协同作用，改善风味，而对其主要指标的影响较小，可明显增加乳酸等有机酸的含量，同时提升了酯类及4-EG (4-乙基愈创木酚)、HDMF(4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮)等风味物质的含量。此外有研究显示，嗜盐四联球菌和耐盐酵母菌共同作用能够使酱油风味物质含量提高116.88%[24]。在盐分只有12%的减盐酱油中，复合使用乳酸菌、酵母菌，检测到其关键挥发性风味物质乙醇、2-甲基-1-丙醇、HDMF和 3-羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮的含量显著提高[25]。

然而，酱醪中两类微生物的相互促进作用在实际生产中更加复杂，乳酸菌和酵母菌之间不一定始终处于平衡状态，也会因形成抑制作用而破裂。酱醪中的氮源有限，微生物对营养资源的利用属于竞争关系，只有找到最合适的使用方法，才能促进互补关系的建立。日本的研究人员认为，为使乳酸菌正常发挥作用，酵母菌的接种量应为105CFU/g，乳酸菌与酵母菌之比应在100∶1～1000∶1范围内，并且酱醪中乳酸菌数达到107CFU/g再引入酵母菌，否则酵母将威胁乳酸菌的生长和代谢[26]。

能够在酱油发酵过程中生长繁殖的耐盐乳酸菌通常产酸能力较弱，耐酸性低，不会因为过度产酸而过度降低酱油的pH值，不会引起酱醪中的中性蛋白酶活性降低，从而影响酱油的品质。这类菌株能够利用糖产生适宜浓度的乳酸，提供柔和的酸味，对咸味起到中和作用，使酱油的口感更加温和，同时，乳酸与酱油中的醇类反应生成乳酸乙酯等酯类，也会成为香气物质的重要组成。据报道，当酱油中乳酸的含量处于0.15 g/dL左右时，其具有较好的口感，而当乳酸含量低于0.05 g/dL时，其口感明显变差[27]。

以酱醪中存在最广泛的嗜盐四联球菌为例，通常条件下，嗜盐四联球菌消耗1 mol葡萄糖会形成近2 mol的L-乳酸，少数菌株能形成正乳酸，而产生的乙酸量较少，乙酸与乳酸的比例因菌株而异，大多数嗜盐四联球菌也可以将柠檬酸转化为乳酸和乙酸，这些柠檬酸来自于原料成曲霉[28]，多种类型有机酸的形成更加丰富了酱油的风味。胡传旺等从发酵酱醪中筛选了多株耐盐乳酸菌，各菌株均能够代谢产生除乳酸以外的其他有机酸，其中两株片球菌属均能产生丰富的乙酸、柠檬酸和富马酸；一株食窦魏斯氏菌能产生乙酸和较多的丙酮酸。

酱油良好的风味来自于有机酸、氨基酸、醇类、酯类等物质，而这些风味物质的形成与微生物代谢密切相关。酱油中的乳酸菌对各种氨基酸具有脱碳作用，可能使酱油中的氨基酸组成发生变化，呈味物质减少，但在一些情况下也可以根据需要利用乳酸菌改善氨基酸结构。部分乳酸菌能够将其他氨基酸转化为具有甜味的丙氨酸，从而提升酱油的风味[29]；日本研究者在酱油制作过程中使用四联球菌，最终增加了酱油的风味物质并且提高了酱油中游离氨基酸的含量[30]。

酱油中的乳酸菌自身也会产生具有香气的挥发性物质。Lee等[31]研究发现，在酱油中接种嗜盐四联球菌后，主要挥发性化合物为乙酸、甲酸、苯甲醛、2-羟基丙酸乙酯、3-(甲硫基)-丙酸、环丁烯和香草醛。相比之下，接种鲁氏酵母的酱油中主要挥发性化合物为乙醇、HDMF、丙酸乙酯、3-甲基-2-丁醇、1-丁醇、2-苯基乙醇和2-甲基丙酸乙酯。由此可以发现，嗜盐四联球菌处理后产生的风味物质主要为酸性化合物，而酵母菌产生的挥发性化合物包括支链或芳香杂醇、醛类和酯类化合物，这一结论充分支持了酵母和乳酸菌具有不同代谢途径的观点，表明在酱油中乳酸菌自身也能够产生其独特的挥发性成分，从而影响酱油的感官品质。戚晨晨等[32]研究发现，添加耐盐乳酸菌能够使酱油风味物质4-乙烯基愈创木酚、苯乙醇和乙酸乙酯等挥发物含量提高，同时提高了酱油中无盐固形物含量的。此外，本公司前期研究中在酱醪中筛选出了一株能够增加4-乙烯基愈创木酚含量的嗜盐四联球菌，对酱油的香气产生正面影响[33]。

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是曾在酱油等多种发酵类食品中产生的有害物质，食用后有致癌的风险，虽然酱油中该物质的形成途径尚不完全清晰，但其前体物质乙醇、瓜氨酸和精氨酸等与微生物的活动有关[34]。部分乳酸菌能够减少酱油中EC的前体物质，对于控制或减少EC的产生、提高发酵类调味品的安全性意义重大。杨希飞[35]开发了一株嗜盐四联球菌，能够显著降低酱油中EC的含量，且对主要理化指标没有影响，最适添加量为106CFU/mL，EC含量降低了53.9%。廖淡宜等[36]从酱醪中筛选出一株嗜盐四联球菌株，能够消耗EC前体物质瓜氨酸和精氨酸，并将其转化为具有优质风味的鸟氨酸。

生物胺作为一类低分子量的活性生物碱，存在于多种发酵食品中，酱油在发酵过程中也存在形成生物胺的风险[37]。明串珠菌属、短乳杆菌等乳酸菌都具有氨基脱羧酶活性，与生物胺的产生密切相关，然而一些乳酸菌能够降低发酵食品中生物胺的生成。有文献报道，部分嗜盐四联球菌添加至酱醪中能够降低酱油中有害物质组胺的形成[38]，杨明泉等[39]从酱醪中筛选得到一株嗜盐片球菌，在发酵初期使用能够显著减少55.21%最终产品的总生物胺含量。

近年来，关于酱油发酵过程中乳酸菌作用的研究逐渐丰富，除了以上几种主要功能外也有其他发现。

酱油成品在货架期过程中产生二次沉淀是一大难题，目前国内已对国产酱油二次沉淀成分、形成机制和去除技术进行了初步研究。杨明泉等筛选得到的嗜盐片球菌在减少生物胺含量的同时也推迟了酱油二次沉淀出现时间，减少了其89.12%的生成量，显著改善了酱油的外观品质。滑欢欢等[40]通过筛选得到的一株乳酸菌也能明显降低酱油二次沉淀的产生，沉淀量仅为对照样的10%。

酱油呈红褐色是氨基酸与糖类发生褐变反应造成的，一些酱油中乳酸菌菌株能够显著降低其生长环境的氧化还原电位，在酱醪中部分抑制了褐变。这类乳酸菌的还原活性来源尚不清楚，但能在褐变反应中还原一部分类醌类中间体，使酱油的色泽更加柔和[41]。

还有一些乳酸菌能够提高酱油的营养价值，例如在食品发酵过程中，魏斯氏菌可将原料分解转化，生成短链脂肪酸和胞外多糖，使酱油更富有营养价值[42]。

乳酸菌虽不是酱油的主要生产菌株，但其功能却不容忽视。随着人们对酱油中乳酸菌研究的不断深入，已经有越来越多的研究者和生产厂家尝试在酱油发酵过程中添加乳酸菌，提升具有特殊功能的乳酸菌的生长优势，从而起到改善风味、提高发酵效率、抑制杂菌等作用。日本酱油在生产过程中大多已将乳酸菌的菌种和添加量作为关键控制因素，但是到目前为止，国内对于酱油中乳酸菌的认识更多停留在理论层面，在实际生产中的应用仍然较少。酱油发酵过程较为复杂、环境开放，若要使具有特定功能的乳酸菌菌株发挥应有的作用则必须改善其发酵条件，对整个发酵过程精准调控。本文对酱油中主要乳酸菌菌种类型及其功能进行了综述，期望能为酱油乳酸菌的功能应用提供基础，为乳酸菌最大程度地发挥功能作用、改善国内酱油的生产工艺和产品品质提供参考。

中国调味品2022年11期