桑葚果酒澄清工艺优化及其品质分析

范少丽，程 平，张志刚，李 宏，杨 璐*

（新疆林业科学院 新疆林果树种选育与栽培重点实验室 新疆林木资源与利用国家林草局重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

摘 要：以桑葚果酒作为研究对象，以透光率为评价指标，通过单因素试验和响应面试验对桑葚果酒澄清工艺进行优化，并对桑葚果酒品质进行分析。结果表明，最优桑葚果酒澄清工艺为：皂土与明胶质量比1.4∶1.0，复合澄清剂添加量0.5%、水浴温度50 ℃、水浴时间38 min。在此优化的条件下，桑葚果酒透光率为58.4%，感官评分为91分，总糖、总酚含量显著降低（P＜0.05）。固相微萃取（SPME）-气质联用（GC-MS）法从澄清前后桑葚果酒中分别共检测出挥发性风味物质25种、29种，除醇类之外，有机酸类、酯类、醛类、酚类及其他类含量均有所下降，说明澄清会对桑葚果酒风味造成一定影响。

关键词：桑葚果酒；澄清工艺；优化；响应面法；挥发性成分

桑葚（Fructus mori）是桑科桑属多年生木本植物，作为独特的药食两用新疆特色林果之一，自古以来就深受当地少数民族的喜爱，不仅是可口营养的水果，也是民间特有的维药药材[1-2]。当代研究表明，桑葚抗氧化能力显著，可以有效提高人体免疫力，对于人体心血管疾病以及一些特殊疾病的预防和治疗有重要的意义[3-4]。因此利用桑葚果实发酵制酒，同样具有一定药理作用。国内对桑葚酒的研究多集中于发酵工艺条件优化以及加工过程中理化性质、风味物质、感官指标等变化。刘玮等[5]采用顶空固相微萃取和气相色谱与质谱联用技术分析了不同产地桑葚酿造的果酒中的香气成分，研究结果显示，不同产地的桑葚发酵果酒中香气成分的种类和酒精含量均有较大差别。孔燕等[6]考察了5株酵母菌株发酵的桑葚酒在陈酿过程中酒精度、总糖和总酸的变化，分析了5种桑葚酒在陈酿过程中抗氧化能力的变化。黄彭等[7]以桑葚为主要原料，酵母A2作为菌种发酵，研究酿制桑葚果酒的发酵工艺条件。通过单因素和正交试验优化，得到菌株A2的最佳发酵条件为糖度170 g/L、SO2用量70 mg/L、接种量9%、发酵温度26 ℃。此条件下发酵结束后，果酒中酒精度可达11.9%vol。

因桑葚果实中含有丰富蛋白质、多糖、矿物质等大分子物质[5-7]，发酵后易出现沉淀和浑浊的现象，既破坏了桑葚果酒的营养价值又影响其风味及品质。引起果酒浑浊沉淀的三大因素，主要为物理化学因素、酶氧化、微生物[8-10]。目前常用的澄清方法可分为三种：自然澄清、机械澄清[11]以及化学澄清，自然澄清耗时长、澄清效果不理想；机械澄清会使果酒色香味损失较大；化学澄清成本低廉，生产者接受度高，效果也相对较好。目前鲜有对桑葚果酒澄清的研究，陆春霞等[12]研究明胶对3个桑葚酒品种的澄清效果。忻胜兵等[13]利用复合澄清剂对经发酵的海红果酒进行澄清处理，研究其对于海红果酒稳定性的影响。

本研究采用不同种类澄清剂对桑葚果酒进行澄清实验，利用单因素试验及响应面试验优化澄清工艺条件，并对桑葚果酒澄清前后理化性质及挥发性物质进行比较，以期筛选出合理有效的澄清方法，为桑葚果酒的实际生产开发提供参考依据。

桑葚果酒：本实验室自制桑葚果酒（发酵结束压榨后静置沉降30 d后的原酒）。交联聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）：意大利DALCIN集团；果胶酶（酶活力＞22 500 U/g）：德国AB酶制剂公司；壳聚糖、明胶（均为分析纯）：郑州艺文食品化工有限公司；皂土：德国爱普斯乐集团；蛋清：市售。

UV-2600型紫外分光光度计：日本岛津公司；WZS-I 型测糖仪：上海光学仪器厂；TP-214型分析天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；7890A-5975C型气相色谱质谱联用仪、65 μm PDMS/DVB萃取纤维头：美国安捷伦公司；UB-7型酸度计：美国赛多利斯公司；D25/DP-9000型色差仪：美国HunterLab公司；0～40°型酒精计：衡水创纪仪器仪表有限公司。

1.3.1 澄清剂的配制

1%PVPP：称取1 g PVPP，用蒸馏水定容至100 mL。

1%果胶酶溶液：量取1 g果胶酶，用蒸馏水浸泡4～6 h后加热搅拌至溶解，冷却后定容至100 mL。

1%壳聚糖溶液：量取1 g壳聚糖，加入1 g柠檬酸，用蒸馏水加热搅拌至溶解，冷却后定容至100 mL[13]。

10%皂土：将10 g皂土于50 mL蒸馏水中浸泡24 h后定容至100 mL，备用[13]。

1%明胶溶液：量取1 g明胶，用90 mL蒸馏水浸泡4～6 h，再加热搅拌至溶解，冷却后定容至100 mL[14]。

5%蛋白液：取蛋清5 g，加入蒸馏水80 mL、0.2 g NaCl搅拌均匀，定容至100 mL[13]。

1.3.2 澄清工艺优化

（1）单因素试验

分别按照1.3.1配制的6种澄清剂，每种澄清剂设置9个不同添加量见表1，各种澄清剂浓度设置参考忻胜兵等[13]方法分别加入50 mL酒样中，搅拌均匀后于20 ℃室温静置，48 h后取上清液测定其透光率和L*值、a*值、b*值，筛选出澄清效果较好的澄清剂和添加量，进行响应面试验。

表1 单因素试验各澄清剂添加量Table 1 Addition of various clarifier in single factor tests

（3）响应面试验

在单因素澄清试验基础上，选取皂土与明胶质量比（A）、复合澄清剂添加量（B）、水浴温度（C）及水浴时间（D）为自变量，以桑葚果酒透光率（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6 软件的Box-Benhnken试验设计原理，对澄清工艺条件进行优化，Box-Benhnken试验设计因素与水平见表2。

表2 Box-Benhnken试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken tests design

1.3.3 分析检测

（1）理化指标测定

透光率：将桑葚果酒8 000 r/min 离心10 min后取上清液，以蒸馏水作空白，用分光光度计全波长扫描，确定测定透光率的最佳波长，并在此波长下测定透光率T（%）；可溶性固形物：用手持糖度计测定；pH：采用酸度计测定；酒精度：采用酒精计法；总糖：采用蒽酮硫酸法[15]；总酸（以酒石酸计）：参照GB/T 12456—2021《食品中总酸的测定》[16]；总酚：采用Folin-酚试剂法[17]；总黄酮（以芦丁计）：采用比色法[18]；花色苷：采用pH示差法[19]；L*值、a*值、b*值：采用色差仪测定[20]。

（2）香气成分分析

香气成分分析采用固相微萃取-气质联用（solid phase microextraction-gaschromatography-mass spectrometry，SPMEGC-MS）法。

萃取方法：在常温下，准确量取5 mL桑葚果酒于20 mL固相微萃取瓶，向瓶中放入磁子，盖紧样品瓶盖，将固相微萃取器的萃取头插入到样品瓶中，推出纤维头（未接触溶液及瓶壁）。于80 ℃下平衡10 min，萃取40 min，吸附后将萃取头直接插入气相色谱质谱联用仪的进样口，进样口温度250 ℃，解吸时间5 min，同时开启仪器并采集数据。

气相色谱条件：毛细色谱柱HP5-MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（He）（99.999%），流速1.00 mL/min；无分流手动进样；进样口温度250 ℃；升温程序：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升温至120 ℃保持2 min，以10 ℃/min升温至250 ℃保持10 min。

质谱条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，传输线温度250 ℃。扫描范围30～550 m/z。

定性定量方法：谱图检索及成分鉴定由SPME-GC/MS操作得到各样品的质谱相对丰度图及总离子流色谱图（total ion chromatogram，TIC）。对TIC中各有效峰代表的化学信息，按照美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）标准谱库11.0，对比气相色谱化合物保留时间数据，结合相关文献，鉴定桑葚果酒挥发物组分中的化学成分，并用峰面积归一化法计算各化合物的相对百分含量。

（3）感官评价方法[21]

组成一个由10位（5男5女）经过选择和培训的评价员的评价小组，分别对澄清前后桑葚酒的澄清度、色泽、香味、滋味4个指标进行感官评价，满分100分，感官评分标准见表3。

表3 桑葚果酒感官评分标准Table 3 Sensory evaluation standards of mulberry wine

桑葚果酒在波长400～800 nm范围内的扫描结果见图1。由图1可知，桑葚果酒的透光率在波长770.5 nm处最高，随后逐渐趋于平缓。因此，在波长770 nm处测定桑葚果酒的透光率。

图1 桑葚果酒全波长扫描光谱图Fig. 1 Full wavelength scanning spectrogram of mulberry wine

2.2.1 PVPP添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响

交联乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）作为一种高效的多酚吸附剂，已广泛应用于啤酒、果汁的工业生产中以解决产品的货架期褐变和沉淀问题[22]。由图2可知，PVPP添加量在0～0.4%范围内，桑葚果酒的透光率随之增大；当PVPP添加量为0.4%时，桑葚果酒的透光率最大，为19.986%；当PVPP添加量为0.4%～0.8%时，桑葚果酒的透光率开始下降，但整体澄清效果不明显。从L*值、a*值、b*值可以看出，PVPP添加量的增加对样品明亮度基本没有影响，当PVPP添加量为0.5%时，b*值减小，酒体颜色偏蓝。因此，PVPP最适添加量为0.4%。

图2 交联聚乙烯聚吡咯烷酮添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响Fig. 2 Effect of polyvinyl pyrrolidone addition on clarity and colour of mulberry wine

2.2.2 果胶酶添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响

果胶酶可以打破、软化果汁中的果胶质，打破其中D-半乳糖醛酸残基之间的糖苷键，使高分子的半乳糖醛酸和多糖链被降解，最终使果汁的黏稠度下降，多用于食品加工中果汁澄清[23]。由图3可知，随着果胶酶添加量在0.5%～0.8%范围内的增加，透光率也在逐渐增加；添加量达到0.7%时透光率达到最大，为77.688%；果胶酶添加量在0.7%～0.8%范围时，透光率逐渐下降。从L*值、a*值、b*值可以看出，果胶酶添加量的增加对样品颜色也逐渐少蓝偏红，样品明亮度基本没有变化。因此，果胶酶最适添加量为0.7%。

图3 果胶酶添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响Fig. 3 Effect of pectinase addition on clarity and colour of mulberry wine

2.2.3 壳聚糖添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响

壳聚糖作为一种天然的高分子螯合剂和阳离子絮凝剂，可使酒液中的悬浮物絮凝而沉淀，从而达到澄清酒液的目的[24]。由图4可知，壳聚糖添加量在0～0.3%范围时，透光率随之逐渐增加；在壳聚糖添加量为0.3%时，透光率最大，为47.86%；但随着壳聚糖添加量的增大，透光率逐渐下降。在壳聚糖添加量为0.6%时，a*值变小，酒液颜色骤然少红，然后逐渐恢复偏红，而b*值则在添加量0.2%时最为偏蓝，然后随着添加量增大，逐渐偏黄，说明壳聚糖对酒液颜色具有轻微减弱作用，但从L*值可以看出整体明亮度没有变化。因此，壳聚糖最适添加量为0.3%。

图4 壳聚糖添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响Fig. 4 Effect of chitosan addition on clarity and colour of mulberry wine

2.2.4 皂土添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响

皂土吸水膨胀后会在溶液中形成带有负电荷的悬浮颗粒，与酒液中带正电荷的浑浊物结合，凝聚沉降，从而使酒液变得澄清，同时可吸附沉淀铁离子，提高果酒抗铁破败病的能力，是最为廉价的常用澄清剂[13]。由图5可知，皂土添加量在0～0.8%范围内增加，桑葚果酒透光率随之逐渐升高；皂土添加量在0.8%时，透光率最高，为51.053%；而后随着皂土添加量的增大透光率逐渐下降。但是a*值与之相反，随着皂土添加量的增加，酒液颜色逐渐少红，在添加量0.4%处最为偏黄，而后随着皂土添加量的增大逐渐偏红。从L*值和b*值得变化可以看出酒液明亮度没有变化，颜色也保持偏蓝。因此，皂土最适添加量为0.8%。

图5 皂土添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响Fig. 5 Effect of bentonite addition on clarity and colour of mulberry wine

2.2.5 明胶添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响

明胶是一种蛋白澄清剂，它能和酒中的单宁结合形成带正电荷的化合物，并吸附酒中带有负电荷的浑浊颗粒形成沉淀，从而达到使桑葚果酒澄清的效果[25]。由图6可知，随着明胶添加量在1%～5%范围内的增加，酒液的透光率随之增大，澄清速度快；当明胶添加量为9%时，酒液的透光率达到最大值，为54.554%；明胶添加量在5%～10%范围内，酒液的透光率有所下降。并且随着皂土添加量的增加，对桑葚果酒的明亮度和颜色也基本无影响。因此，明胶最适添加量为9%。

图6 明胶添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响Fig. 6 Effect of gelatin addition on clarity and colour of mulberry wine

2.2.6 蛋白液添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响

蛋白液与酒液中的单宁化合，形成不溶性单宁盐沉淀，同可以除去过多的单宁减少二次沉淀产生，多用于细致的浅色果酒的澄清[13]。由图7可知，蛋白液的添加对桑葚果酒有一定澄清作用，蛋白液添加量在0～0.10%范围内，随着蛋白液添加量的增加，透光率随之上升；当蛋白液添加量在0.10%时，透光率最大，为34.37%；蛋白液添加量＞0.10%之后，透光率逐渐下降。当蛋白液添加量在0.14%时，此时酒液颜色最为少红偏黄，而后逐渐偏红蓝，同时从L*值可以看出，蛋白液添加量的增加对样品明亮度基本没有影响。因此，蛋白液最适添加量为0.10%。

图7 蛋白液添加量对桑葚果酒澄清度及颜色的影响Fig. 7 Effect of protein solution addition on clarity and colour of mulberry wine

2.2.7 不同澄清剂对桑葚果酒澄清效果比较

对比单因素试验中各澄清剂最适添加量的最高透光率，结果见图8。由图8可知，PVPP、果胶酶、壳聚糖、皂土、明胶、蛋白液这6种澄清剂对桑葚果酒均有一定澄清作用，但作用效果存在很大差异。皂土和明胶沉淀量大，沉淀速度快，明胶相对而言澄清效果最佳，皂土澄清效果次之，透光率分别为54.554%、51.053%。壳聚糖和蛋白液澄清作用与前两种相比较弱。PVPP和果胶酶澄清速度较慢，沉淀量较小，透光率较低。因此，选择明胶和皂土作为复合澄清剂。

图8 6种澄清剂对桑葚果酒的澄清效果比较Fig. 8 Comparison of 6 clarifies on clarification effects of mulberry wine

以单一澄清剂试验结果为依据，选取皂土与明胶质量比（A）、复合澄清剂添加量（B）、水浴温度（C）及水浴时间（D）为自变量，以桑葚果酒透光率（Y）为响应值，应用Box-Behnken试验设计和响应面分析法优化桑葚果酒澄清工艺，Box-Behnken试验设计及结果见表4，方差分析见表5。

运用Design-Expert 8.0.6软件将表4数据进行多元回归拟合，得到桑葚果酒澄清工艺参数的二次回归方程为：

表4 Box-Benhnken试验设计及结果Table 4 Design and results of Box-Benhnken tests

由表5可知，模型P值＜0.001，表明该二次方程模型极显著，失拟项P值=0.056 7，失拟项不显著，表明该模型与试验结果拟合程度良好。模型决定系数R2为0.952 5，校正决定系数R2adj为0.905 1，变异系数为0.083，说明模型回归方程与实际拟合度较好。分析各因素P值可知，一次项A、D，二次项A2、B2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；交互项BC、CD对结果影响显著（P＜0.05）。分析F值可知，影响桑葚果酒透光率的的顺序由大到小为D水浴时间＞A皂土与明胶质量比＞B复合澄清剂添加量＞C水浴温度。

表5 回归模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

续表

注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。

响应面和等高线是各因素对响应值影响的直观反映，从响应面坡度及等高线形状可以看出两因素交互关系，各因素之间交互作用响应面及等高线见图9。由图9可知，有极显著的交互作用的因素为复合澄清剂添加量和水浴温度（P＜0.01），其他因素之间交互效应不显著（P＞0.05），这与表5结论一致。

图9 各因素间交互作用对桑葚果酒透光率的影响的响应面及等高线Fig. 9 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on transmittance of mulberry wine

利用模型得到桑葚果酒的最佳澄清工艺条件为复合澄清剂添加量0.496%、水浴温度50 ℃、水浴时间37.8 min、皂土与明胶质量比为1.42∶1.00。在此条件下，透光率预测值为60.65%。为了方便实际操作，将最优澄清工艺条件调整为复合澄清剂添加量0.5%、水浴温度50 ℃、水浴时间38 min、皂土与明胶质量比为1.4∶1.0。此澄清条件下测得透光率实际值为58.441%，结果表明实际测量值接近预测值，说明回归模型有效可行。

2.4.1 澄清处理对桑果酒理化指标影响

由表6可以看出，复合澄清处理对桑葚酒的整体理化指标影响不显著（P＞0.05），尤其是对酒液色泽基本无影响，其余理化指标较原酒含量略有降低，其中总糖、总酚含量显著降低（P＜0.05），因为澄清剂在吸附酒中大分子物质，使其澄清透明的同时，也会吸附一定量的不溶性糖，同时通过澄清处理可以去除桑葚果酒部分单宁，降低涩味，提升口感。

表6 桑葚果酒澄清前后理化指标比较Table 6 Comparison of physicochemical indicators of mulberry wine before and after clarification

续表

注：同行不同小写字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。

2.4.2 澄清处理对桑葚果酒挥发性香气物质的影响

通过SPME-GC/MS检测分析澄清前后桑葚果酒挥发性香气物质，结果见表7。由表7可知，澄清前后桑葚果酒中分别检出25种、29种挥发性化合物，主要挥发性化合物均为醇类和酯类，酯类化合物中相对含量最高均为癸酸乙酯和十二酸乙酯。酯类物质总体相对含量显著下降，特别是癸酸乙酯，澄清前后由16.347%减少为9.270%，但是其中苯丙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六烷酸乙酯和亚油酸乙酯的相对含量大幅增加。有机酸类化合物明显减少，其中辛酸、苯甲醛等具有不悦气味的挥发性化合物，经过复合澄清后也相应减少和消失。但是除醇类之外，酯类、醛类、酚类含量均有所下降，澄清处理后桑葚果酒主要挥发性化合物相对含量下降，但是种类有所增加，可能是呈脂肪味挥发性物质含量下降，使得丁酸乙酯、9-己癸酸乙酯、1-癸烯等温和愉悦的果香突显出来，说明澄清会对桑葚果酒风味造成一定影响，但是影响是正向的，因为含量下降的香气物质大部分呈脂肪味，说明澄清处理后的酒样脂肪味减少，酒香更加清醇。

表7 澄清前后酒样中挥发性香气化合物的GC-MS分析结果Table 7 Results of volatile aroma compounds in wine samples before and after clarification analyzed by GC-MS

续表

注：“/”表示未检出。

2.4.3 澄清处理对桑葚果酒感官品质的影响

澄清处理前后桑葚果酒酒样的感官分析雷达图见图10。由图10可知，复合优化澄清处理后的桑葚果酒的澄清度和外观明显高于原酒，香味和滋味没有太大变化，但是感官评分为91分，显著高于澄清前原酒感官评分（66分）。

图10 澄清处理对桑葚果酒感官品质的影响Fig. 10 Effects of clarification treatment on sensory quality of mulberry wine

单因素试验及响应面法优化得到最佳澄清工艺为：皂土与明胶质量比为1.4∶1.0、复合澄清剂添加量0.5%、水浴温度50 ℃、水浴时间38 min。在此优化条件下，桑葚果酒透光率为58.4%，与未经澄清处理的果酒相比提高了49.34%，但是透光率还是整体偏低，后期可通过延长澄清剂下胶时间、增加复合澄清剂种类等方式来进一步提高果酒透射率。皂土与明胶混合使用，配合稍高温度水浴处理，加速沉降，较常见的常温静置澄清效率有很大提升，且稳定性明显提高。酒液色泽为深紫宝石红色具有本品应有的色泽，澄清透明无悬浮物。感官评价结果显著高于原酒。复合澄清后酒样中有机酸类、酯类化合物相对含量有所下降，基础理化指标无显著变化，但是酚类化合物有所减少。

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Clarification process optimization and quality analysis of mulberry wine

FAN Shaoli,CHENG Ping,ZHANG Zhigang,LI Hong,YANG Lu*(Key Laboratory of Forest Resources and Utilization,Xinjiang of National Forestry and Grassland Administration,Key Laboratory of Fruit Tree Species Breeding and Cultivation in Xinjiang,Xinjiang Academy of Forestry Sciences,Urumqi 830054,China)

Abstract：Taking mulberry wine as research object and light transmittance as evaluation index,the clarification process of mulberry wine was optimized through single factor tests and response surface tests,and the quality of mulberry wine was analyzed.The results showed that the optimum clarification process of mulberry wine was bentonite and gelatin mass ratio 1.4∶1.0,compound clarifier addition 0.5%,water bath temperature 50 ℃and time 38 min.Under the optimized conditions,the light transmittance of mulberry wine was 58.4%,the sensory score was 91,and the contents of total sugar and total phenol decreased significantly(P＜0.05).A total of 25 and 29 volatile flavor substances in mulberry wine before and after clarification were detected by solid phase microextraction(SPME)-GC-MS.Except alcohols,the contents of organic acids,esters,aldehydes,phenols and others decreased,indicating that clarification had a certain impact on the flavor of mulberry wine.

Key words：mulberry wine;clarification technology;optimization;response surface method;volatile compound

中图分类号：TS262.7

文章编号：0254-5071（2022）05-0174-08

doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2022.05.031

引文格式：范少丽，程平，张志刚，等.桑葚果酒澄清工艺优化及其品质分析[J].中国酿造，2022，41（5）：174-181.

收稿日期：2021-11-05

修回日期：2021-12-22

基金项目：自治区林果业基础研究专项资金（LGXY202108）；自治区公益性科研院所项目（ky2019052）

作者简介：范少丽（1990-），女，助理研究员，硕士，研究方向为林果资源研究利用。

*通讯作者：杨 璐（1985-），女，副研究员，硕士，研究方向为植物资源化学与生物活性物质。