新的冠状病毒文献中国与人类呼吸系统疾病有关的新冠状病毒

加速文章预览中国一种与人类呼吸道疾病相关的新型冠状病毒收稿日期：2020 年 1 月 7 日接受日期：2020 年 1 月 28 日Fan Wu, Su Zhao, Bin Yu, Yan-Mei Chen, Wen Wang, Zhi-Gang Song, Yi Hu, Zhao-W Tao, Jun-Hua Tian, Yuan-Yuan Pei, Ming-Li Yuan, Yu-Ling Zhang, Fa-Hui Dai, Yi Liu, Qi-Min Wang, 郑娇娇、林旭、Edward C. Holmes 和 Yong-Zhen Zhang加速文章预览2020 年 2 月 3 日在线发布 将这篇文章引用为：Wu, F. 等。中国一种与人类呼吸道疾病相关的新型冠状病毒。自然 https://doi. org/10.1038/s41586-020-2008-3 (2020)。开放获取这是已被接受发表的同行评审论文的 PDF 文件。虽然未经编辑，但内容已进行初步格式化。 Nature 正在为我们的作者和读者提供这种早期版本的排版纸作为服务。在论文以最终形式发表之前，文本和图表将经过编辑和校对审查。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，所有法律免责声明均适用。自然 | www.nature.com 文章中国一种与人类呼吸道疾病相关的新型冠状病毒收稿日期：2020 年 1 月 7 日Fan Wu1,6, Su Zhao2,6, Bin Yu3,6, Yan-Mei Chen1,6, Wen Wang4,6, Zhi-Gang Song1,6, Yi Hu2,6, Zhao-Wu Tao2, Jun-Hua Tian3, Yuan-Yuan Pei1, Ming-Li Yuan2, Yu-Ling Zhang1, Fa-Hui Dai1, Yi Liu1, Qi-Min Wang1, Jiao-Jiao Zheng1, Lin Xu1, Edward C. Holmes5 & Yong-Zhen Zhang1,4*接受日期：2020 年 1 月 28 日Published online: 3 February 2020 Open accessSARS 和寨卡病毒等新发传染病对公共卫生构成重大威胁 1-3。尽管进行了大量的研究工作，但新疾病如何、何时、何地出现仍然是相当不确定的来源。中国湖北省武汉市最近报道了一种严重的呼吸道疾病。截至2020年1月25日，自2019年12月12日首例患者入院以来，已报告至少1975例病例。流行病学调查表明，此次疫情与武汉的一个海鲜市场有关。我们研究了一名在市场工作的患者，他于 2019 年 12 月 26 日入住武汉市中心医院，患有严重的呼吸系统综合症，包括发烧、头晕和咳嗽。支气管肺泡灌洗液样本的宏基因组 RNA 测序 4 鉴定了一种来自冠状病毒科的新型 RNA 病毒，此处设计为 WH-Human-1 冠状病毒。对完整病毒基因组（29,903 个核苷酸）的系统发育分析表明，该病毒与之前从中国蝙蝠中采样的一组 SARS 样冠状病毒（β冠状病毒属，Sarbecovirus 亚属）最密切相关（核苷酸相似性为 89.1%）。这次爆发突显了动物病毒外溢对人类造成严重疾病的持续能力。研究的患者是一名 41 岁的男性，没有肝炎、肺结核或糖尿病病史。 他于 2019 年 12 月 26 日，即发病 6 天后在武汉市中心医院入院并住院。 患者在就诊时报告发烧、胸闷、干咳、疼痛和虚弱 1 周（表 1）。 心血管、腹部和神经系统检查均正常。 观察到轻度淋巴细胞减少（每立方毫米少于 900 个细胞），但在全血细胞计数 (CBC) 测试中，白细胞和血小板计数正常。 C 反应蛋白 (CRP, 41.观察到 4 mg/L 的血液，参考范围 0-6 mg/L），并且在血液化学测试中天冬氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶的水平略有升高。 动脉血气（ABG）测试显示，患者有轻度低氧血症，氧含量为 67 mmHg。 入院第一天（发病后第 6 天），胸片异常，并伴有气腔阴影，例如双肺磨玻璃影、局灶性实变和斑片状实变（扩展数据图 1）。 1）。 胸部计算机断层扫描 (CT) 扫描显示双侧局灶性实变、肺叶实变和斑片状实变，尤其是在下肺。 入院后第 5 天（发病后第 11 天）胸片显示双侧弥漫性斑片状模糊阴影。初步的病原学调查排除了流感病毒、肺炎衣原体和肺炎支原体的存在。商业病原体抗原检测试剂盒并通过PCR确认。其他常见的呼吸道病原体，包括腺病毒，qPCR 也呈阴性（扩展数据图 2）。尽管给予抗生素、抗病毒和糖皮质激素联合治疗，但患者表现出呼吸衰竭并给予高流量无创通气。经过三天的治疗，患者的病情没有好转，他被收入重症监护室（ICU）。患者入院6天后转至武汉另一家医院继续治疗。武汉市疾病预防控制中心（CDC）的流行病学调查显示，该患者在当地一家室内海鲜市场工作。值得一提的是，在疫情爆发前，市场上除了鱼类和贝类外，还有刺猬、獾、蛇、鸟（斑鸠）等多种野生活体动物，以及动物尸体和动物肉。没有蝙蝠可供出售。虽然患者可能接触过市场上的野生动物，但他回忆说没有接触过活禽。为了研究与这种疾病相关的可能病因，我们收集了支气管肺泡灌洗液 (BALF) 并进行了深度宏转录组测序。临床标本在上海公共卫生临床中心的生物安全三级实验室处理。从 200μl BAL 液中提取总 RNA，并构建了双端 (150 bp) 的宏转录组文库1上海公共卫生临床中心和复旦大学公共卫生学院，上海，中国。 2华中科技大学同济医学院附属武汉市中心医院肺与危重症医学科，武汉 430014 3武汉市疾病预防控制中心，湖北省武汉市。 4中国疾病预防控制中心国家传染病预防控制研究所人畜共患病科，北京昌平。 5Marie Bashir 传染病和生物安全研究所，生命与环境科学学院和医学科学学院，悉尼大学，澳大利亚悉尼。 6这些作者的贡献相同：范武、赵苏、于斌、陈艳美、王文、宋志刚、胡一。 *邮箱：[email protected]自然 | www.nature.com |1 文章如前所述，使用 Illumina MiniSeq 进行测序 4–7。我们总共生成了 56,565,928 个序列读数，这些读数是从头组装并筛选潜在病因的。在 Megahit8 组装的 384,096 个重叠群中，最长的（30,474 个核苷酸 [nt]）具有高丰度，并且与蝙蝠 SARS 样冠状病毒分离株 - bat-SL-CoVZC45（GenBank Accession MG772933）密切相关 - 先前采样在中国，nt 同一性为 89.1%（补充表 1 和 2）。这种新型病毒的基因组序列及其末端分别通过 RT-PCR9 和 5'/3' RACE 试剂盒 (TaKaRa) 确定和确认。这种新病毒被命名为 WH-Human 1 冠状病毒 (WHCV)（也被称为“2019-nCoV”），其全基因组序列（29,903 nt）已被指定为 GenBank 登录号 MN908947。针对 WHCV 的完整基因组重新映射 RNA-seq 数据导致组装了 123,613 个读数，在 6.04X 的平均深度（范围：0.01X -78.84X）下提供 99.99% 的基因组覆盖率（扩展数据图 3）。 BALF 样品中的病毒载量通过定量 PCR (qPCR) 估计为 3.95×108 拷贝/mL（扩展数据图 4）。WHCV 的病毒基因组组织的特征在于与 β 冠状病毒属的两个代表性成员的序列比对：人源冠状病毒（SARS-CoV Tor2，AY274119）和蝙蝠源冠状病毒（Bat-SL-CoVZC45，MG772933）。 基于此序列比对和 ORF 预测，绘制了 WHCV 的非翻译区 (UTR) 和开放阅读框 (ORF)。 WHCV 病毒基因组与这两种冠状病毒相似（图 1）。 1 和补充表 3)，基因顺序为 5'-复制酶 ORF1ab-S-envelope(E)-membrane(M)-N-3'。 WHCV 具有典型的 β 冠状病毒的 5' 和 3' 末端序列，5' 末端为 265 nt，3' 末端区域为 229 nt。 WHCV 的预测复制酶 ORF1ab 基因长度为 21,291 nt，包含 16 个预测的非结构蛋白（补充表 4），随后是（至少）13 个下游 ORF。 此外，WHCV 在 nsp1 中与 SARS-CoV 共享一个高度保守的结构域（LLRKNGNKG：氨基酸 122-130）。 WHCV 的预测 S、ORF3a、E、M 和 N 基因的长度分别为 3,822、828、228、669 和 1,260 nt。 除了这些由 Sarbecovirus 亚属所有成员共享的 ORF 区域外，WHCV 与 SARS-CoV 的相似之处在于它携带一个预测的 ORF8 基因（长度为 366 nt），位于 M 和 N ORF 基因之间. WHCV ORFs的功能是根据已知冠状病毒的功能预测的，并在补充表5中给出。以类似于 SARS CoV Tor2 的方式，可以很容易地在 ORF 的 5' 端上游鉴定一个前导转录调控序列（TRS）和九个推定的主体 TRS，推定的保守 TRS 核心序列以两种形式出现—— ACGAAC 或 CUAAAC（补充表 6）。为了确定 WHCV 与先前鉴定的冠状病毒之间的进化关系，我们根据全基因组序列的核苷酸序列、非结构蛋白基因 ORF1a 和 1b 以及由 S、E、M 和N 个基因（图 2 和扩展数据图 5）。在所有系统发育中，WHCV 都与 Sarbecovirus 亚属成员聚集在一起，包括导致 2002-20031,2 全球 SARS 大流行的 SARS-CoV，以及从蝙蝠中采样的许多 SARS 样冠状病毒。然而，WHCV 根据使用的基因改变了 Sarbecovirus 亚属内的拓扑位置，这表明该组病毒的重组历史（图 2 和扩展数据图 5）。具体来说，在 S 基因树（扩展数据图 5）中，WHCV 与蝙蝠冠状病毒 bat-SL-CoVZC45 的关系最密切，具有 82.3% 的氨基酸 (aa) 同一性（与 SARS CoV 的氨基酸（aa）同一性约为 77.2% ；补充表 3)，而在 ORF1b 系统发育中，WHCV 落在 Sarbeco-virus 亚属中的基础位置（图 2）。在估计复制酶多蛋白 pp1ab 中保守结构域的系统发育树中也观察到了这种拓扑划分，可能反映了蝙蝠 sarbecoviruses 之间的重组（扩展数据图 6）。为了更好地了解 WHCV 感染人类的潜力，将其刺突蛋白的受体结合域 (RBD) 与 SARS-CoV 和蝙蝠 SARS 样 CoV 中的受体结合域 (RBD) 进行了比较。 WHCV 的 RBD 序列与 SARS-CoV 的 RBD 序列更密切相关（73.8%-74。9% aa 同一性）和 SARS 样 CoV，包括菌株 Rs4874、Rs7327 和 Rs4231（75.9%-76。9% aa 同一性），能够使用人类 ACE2 受体进入细胞（补充表 7）10。 此外，WHCV RBD 仅比 SARS-CoV RBD 长一个氨基酸（扩展数据图 1）。 7a)。 相比之下，其他蝙蝠 SARS 样 CoV，包括不能使用人类 ACE211 的 Rp3 菌株，与 SARS-CoV 相比，在 473-477 和 460-472 位点有氨基酸缺失（扩展数据图 1）。 7a)。 先前确定的 SARS-CoV RBD 与人 ACE2 (PDB 2AJF) 复合的 12 晶体结构表明，区域 473-477 和 460-472 直接与人 ACE2 相互作用，因此可能对确定物种特异性很重要（扩展数据图 2）。 7b)。 我们使用 SWISS-MODEL 服务器通过蛋白质同源性建模预测了 WHCV、Rs4874 和 Rp3 RBD 域的三维蛋白质结构，并将它们与 SA