ANNOVAR

会得到一系列变异数据，这些变异数据只是告诉我们在基因组的某个位置发生了一段序列的改变，至于这个改变会不会影响生物学功能，我们并不清楚。而注释就是将基因组的序列变异数据转化为我们更关心的生物学功能变化的信息。

Annovar常被用在人类基因组的注释上，其实，它也可以对人类以外的基因组数据进行注释。比如，老鼠基因组的注释上。需要自己进行建立注释信息。

ANNOVAR是一个perl编写的命令行工具，能在安装了perl解释器的多种操作系统上执行。允许多种输入文件格式，包括最常被使用的VCF格式。输出文件也有多种格式，包括注释过的VCF文件、用tab或者逗号分隔的text文件。

ANNOVAR能快速注释遗传变异并预测其功能。类似的variants注释软件还有 VEP, snpEff, VAAST, AnnTools等等.

ANNOVAR 注释变异可以分成有基于基因、基于染色体区间和变异数据等三种类型. 这三种注释分别针对于每一个variant的不同方面：

基于基因的注释（gene-based annotation） 注释结果为突变位点位于基因的相对位置，是否改变氨基酸编码，确定受影响的氨基酸，获得变异位点的HGVS命名方式，揭示variant与已知基因直接的关系以及对其产生的功能性影响。可灵活使用RefSeq genes, UCSC genes, ENSEMBL genes, GENCODE genes或许多其他基因定义系统。

基于染色体区间的注释（region-based annotation） 识别特定基因组区域的变异，例如，44个物种中的保守区域，预测的转录因子结合位点, segmental duplication regions, GWAS hits, ChIP-Seq peaks, RNA-Seq peaks等等许多其他的在基因组区间的注释；

变异数据库的注释 / 基于过滤的注释（ filter-based annotation ） 则给出这个variant的一系列信息，如： population frequency in different populations 和various types of variant-deleteriousness prediction scores, 这些可被用来过滤掉一些公共的及 probably（大概,肯定的成分较大,是most likely） nondeleterious variants. 包括Clinvar, dbSNP, Cosmic, ExAC, gnomAD等等，突变数据库整理可参考从 vcf 文件准备 ANNOVAR 数据库。鉴定特定数据库中记录的变异，例如，该变异位点是否在dbSNP中有报道，在千人基因组计划中的等位基因频率如何等等。

ANNOVAR 数据库文件实际上为特定格式的文本文件，其数据库文件命名规则为: ${path_database}/${buildver}_${database_name}.txt

ANNOVAR 所有注释结果都在 vcf 文件 INFO 列添加key-value

下载地址

填写登记表，下载ANNOVAR软件（http://annovar.openbio informatics.org/），解压文件

解压后生成annovar文件夹，里面有6个perl脚本程序和2个文件夹。

自带了humandb是已经建立好的hg19或者GRCh37等常用的数据库，可用于人的注释。 如果要进行其他注释，需要使用 -downdb命令下载数据库到 humandb/ 目录。

对于基于基因的注释的数据库已经在下好的 ANNOVAR package中了。如果要进行其他注释，需要按以下命令下载数据库到 ‘humandb/’ 目录里：

这里下载的是几个通常用到的数据库： 1）cytoBand 是每个细胞间band（cytogenetic band）的染色体坐标信息 , 2）1000g2014oct 　　　　for alternative allele frequency in the 1000 Genomes Project (version October 2014), 　　　　是2014年10版，1000基因组项目（和ExAV 外显子集合联合一样，是公开、开放的数据库） 　　　　里面供选择的等位基因频率信息 3）exac03 　　　　for the variants reported in the Exome Aggregation Consortium (version 0.3), 　　　　是0.3版外显子集合联合中报道过的variants. 4）ljb26_all 　　　　for various functional deleteriousness prediction scores from the dbNSFP database (version 2.6), 　　　　 dbNSFP: A Lightweight Database of Human NonsynonymousSNPs and TheirFunctionalPredictions on ResearchGate 5）clinvar_20140929 　　　　for the variants reported in the ClinVar database (version 20140929) 　　　　ClinVar是美国国家生物技术信息中心（NCBI）于2012年11月宣布、2013年4月正式启动的公共、免费数据库。作为核心数据库，ClinVar数据库整合了十多个不同类型数据库、通过标准的命名法来描述疾病，同时支持科研人员将数据下载到本地中，开展更为个性化的研究。在遗传变异和临床表型方面，NCBI和不同的研究组已经建立了各种各样的数据库，数据信息相对比较分散，ClinVar数据库的目的在于整合这些分散的数据、将变异、临床表型、实证数据以及功能注解与分析等四个方面的信息，通过专家评审，逐步形成一个标准的、可信的、稳定的遗传变异-临床表型相关的数据库。 6）snp138 　　　　for the dbSNP database (version 138).

注意： 　　(i) 第一个命令中不包含 --webfrom annovar 选项, 因此是从the UCSC Genome Browser annotation database下载文件的； 　　(ii) --buildver hg19 选项是针对hg19这一版的基因组的； 　　(iii) 运行上面命令后，在 humandb/ 目录下会多几个以 hg19为前缀的文件。

输入下列命令，用之前下载好的注释数据库来注释vcf格式文件中的variants。ANNOVAR 所有注释结果都在 vcf 文件 INFO 列添加key-value。输出的csv文件将包含输入的5列主要信息以及各个数据库里的注释。

参考输入的vcf文件的名称 　　--protocol 选项后跟注释来源数据库的准确名称 　　--operation选项后跟注释的类型: 　　　　g 表示基于基因的注释（gene-based annotation）； 　　　　r 表示基于区域的注释（region-based annotation）； 　　　　f 表示基于筛选子的注释（ filter-based annotation）； 　　--outfile 选项是指定输出文件的前缀

关键步骤： 　　1、确保注释数据库的名称正确并且是按你想要在输出文件中显示的顺序排列的； 　　2、确保 --operation指定的注释类型顺序和--protocol指定的数据库顺序是一致的； 　　3、确保每个protocal名称或注释类型之间只有一个逗号，并且没有空白。

final.hg19_multianno.vcf.输出文件应该是以个VCF格式文件，INFO那列以 key=value 形式、 ;分割成几个小区域. eg:Func.refGene=intronic;Gene.refGene=SAMD11. 每个键值对代表一个ANNOVAR注释信息。输出文件可以用为VCF格式文件设计的基因分析软件进一步处理。

final.hg19_multianno.txt. 每一行代表一个variant 。用tab分隔，多余列为加上的注释信息，顺序按 --protocol选项所设定的注释类型argument。

Annovar常被用在人类基因组的注释上，其实，它也可以对人类以外的基因组数据进行注释。annovar一般只包含人类基因组注释数据库，其他的物种需要自己进行建立注释信息。

一般如果你想看是否有某种物种,如小鼠mm9的注释库时，命令行运行

会生成一个mm9开头的文件，里面包含小鼠mm9有多少注释数据库，然后自己可以构建一个mousedb数据库 先在annovar文件夹里面创建mousedb文件夹（名字可自取），命令mkdir mousedb 然后使用annovar文件夹下的perl程序annotate_variation.pl

这个命令能实现的是帮忙下载mm9的refGene的文件，保存在mousedb文件下，自动解压后文件名为mm9_refGene.txt。 然后程序会提示使用以下两个命令继续建库

同样在annovar文件下运行这两个perl程序

通过这个命令，会在mousedb下创建文件夹mm9_seq，并且在里面下载mm9的基因组文件chromFa.tar.gz，perl程序帮忙解压后是按染色体分开的fasta格式文件。 然后继续运行perl程序

该程序会会在mousedb下创建mm9_refGeneMrna.fa文件，是根据mm9_refGene.txt的信息，重新构建成的老鼠转录表达基因fasta格式文件 这样老鼠mm9 annovar gene based注释库就弄好了 以文本文件test.input为案例进行测试 生成test.input的txt格式文件，根据annovar官网介绍，只要这最基本的五列信息就可以进行注释，五列分别染色体名称，染色体上的位置，染色体上的位置，参考基因组碱基，变异碱基。

然后使用perl程序进行gene based的注释

注释后会生成test.variant_function，test.exonic_variant_function和test.log文件，前两个即为所需要的文件。用这个例子输出test.exonic_variant_function文件输出为空文件，因为这些位点没有在exonic区域的，所以没有结果。如果有位点在exonic中，则在test.exonic_variant_function中会更具体的描述为同义突变还是非同义突变

对于gene-based annotation， ANNOVAR需要 genePred format 的 gene definition file和 FASTA format 的 transcript sequence file；

第一步：输入以下命令，下载大猩猩基因组定义文件（ gene definition file）及序列的 FASTA 文件到chimpdb/目录

运行过程中，出现下列提示

第二步：注意ANNOVAR数据库中只包含人类基因组已建好的转录本，不包含其他物种的。故需要按以下命令自行建立对应物种的transcript FASTA file

--seqdir说明下载的序列文件的所在目录； --format说明 gene definition file的格式.； --outfile 指定输出mRNA 序列文件的名称；

关键：跟在--outfile后的输出文件名应该是 _refGeneMrna.fa这种形式，否则下一步找不到正确的 transcript FASTA sequence file.

第三步：注释variants，with the chimpanzee gene annotation:

input VCF file； chimpdb/ directory of the downloaded data；

第四步：输出结果文件核对。 final.panTro2_multianno.txt file. The gene annotation for chimpanzee is added after the input variants.

关键：如果没有现成可用的gene definition file ，可以将基因预测工具产生的 GFF3 or GTF 文件转换成 gene definition file.

ANNOVAR可以从服务器下载注释库，但是主要针对人类基因组，那么需要分析、注释其它的物种测序结果，怎么办呢，需要自建注释库。

第一步：准备工作 首先，需要参考基因组的序列和注释文件，这里是名为zunla辣椒

ANNOVAR 建库需要 genePred 文件，因而需要准备几个转换 gff3 到 genePred 格式的软件

gffread的下载地址，需要自行编译。编译过程会自行下载https://github.com/gpertea/gclib，也可以预先下载，然后make。

推荐直接conda安装

gtfToGenePred的下载地址，已经编译好了，下载直接使用，他属于UCSC工具包，因而在conda环境安装gtfToGenePred的命令为

conda直接安装gtftogenepred没成功，需要加上UCSC前缀。

第二步：建立注释库

创建辣椒注释库的文件夹pepperdb，然后进去

转换gff3 为 gtf，推荐使用GTF格式，因为有些GFF3格式文件转换可能不正确

转换gtf 为 GenePred

建立注释库

这样我们的建库就完成了，获得两个重要的文件

强调：关于文件的命名，按照常规逻辑，这两个文件肯定不能随便命名，不然annovar无法识别！摸索了一下，前缀就是下面build参数使用的名字，这里就是zunla，下面注释就要使用“-build zunla”这个参数，对于基于基因注释的txt文件命名就是refGene，连起来就是 zunla_refGene.txt。而fa文件前缀一样，后面有稍稍差别为refGeneMrna，连起来就是zunla_refGeneMrna.fa。

第三步：转换需要注释的vcf文件

BB3.HC.vcf是HaplotypeCaller得到的vcf文件，转换成适用annovar的文件格式。得到的BB3.avinput就是我们需要注释的文件

ANNOVAR主要使用convert2annovar.pl程序进行转换，转换后文件是精简过的，主要包含前面提到的5列内容，如果要将原格式的文件的所有内容都包含在转换后的.avinput文件中，可以使用-includeinfo参数；如果需要分开每个sample输出单一的.avinput文件，可以使用-allsample参数，等等。

ANNOVAR还主要支持以下格式转换：

第四步：annotate_variation注释

-geneanno -dbtype refGene是默认值，可以省略，那么命令也可以写成

得到结果文件：

第五步：table_annovar.pl注释

table_annovar.pl是ANNOVAR多个脚本的封装，可以一次性完成三种类型的注释。

我这里只有regGene类型的注释库，那么注释命令为

table_annovar.pl也可以不经过转换，直接对vcf文件进行注释，添加-vcfinput参数就行，注释的内容将会放在vcf文件的“INFO”那一栏。但是需要注意的是不能和-csvout参数同时使用，命令如下

所以，两种输入格式

该格式每列以tab分割，最重要的地方为前5列，分别是:

ANNOVAR主要也是依靠这5处信息对数据库进行比对，进而注释变异。

报错：

问题依旧！

没办法，只能跑去table_annovar.pl脚本的444行看一下具体代码

444行的内容为system ($sc) and die "Error running system command: \n"; 看得出来，这里执行了system系统命令，往上查找变量$sc的值，发现这里调用了annotate_variation.pl脚本，同样

为了避免别的脚本权限问题，干脆全部777

成功解决权限问题。

第一步：准备 下载Arabidopsis 的 GTF file 和 genome FASTA file，到 ‘atdb’目录下。解压文件。 地址

**第二步： 用 gtfToGenePred 工具将 GTF file 转换 GenePred file

用retrieve_seq_from_fasta.pl生成 transcript FASTA file

After this step, the annotation database files needed for gene-based annotation are ready. Now you can annotate a given VCF file using the procedure starting from B(iii). Please note that the ‘--buildver’ argument should be set to ‘AT’. 参考http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/user-guide/gene/ for more details.bases and other arguments are the same as in the human genome annotation.

总脚本如下

然后用下面这个脚本批量注释

Reading gene annotation from /home/jmzeng/bio-soft/annovar/humandb/hg19_refGene.txt ... Done with 50914 transcripts (including 11516 without coding sequence annotation) for 26271 unique genes

最后查看结果可知，真正在外显子上面的突变并不多

annovar软件就是把我们得到的十万多个snp分类了，看看这些snp分别是基因的哪些位置，是否引起蛋白突变

其中（每种数据库对应的类型参考官网） g,gene-based,对应数据库为refGene,ensGene等 r,region-based,对应数据库为cytoBand等 f,filter-based,对应数据库为exac03,avsnp147,dbnsfp30a等

结果文件在example/中，ex1.avinput.variant_function和ex1.avinput.exonic_variant_function （1）ex1.avinput.variant_function

第1列：variant effects,将变异分类，如intergenic, intronic, non-synonymous SNP, frameshift deletion, large-scale duplication等 第2列：基因名，Symbol，括号中为NM_22222,为refGene编号 其余列：输入文件ex1.avinput的内容

（2）ex1.avinput.exonic_variant_function

第1列：该变异在input文件的行号 第2列：对编码基因的影响，frameshift,nonsynonymous等 第3列：被影响的基因或转录本,其中NM_22222,为refGene编号 其余列：同输入文件

用awk操作时，分隔符设定为\t；不设置时，空格也被当做分隔符，会造成错位

鉴定各变异的cytogenetic band,如1p36.33 结果文件在example中，ex1.avinput.hg19_cytoBand

第1列：cytoBand 第2列：1p21.1 其余列：同输入文件

结果文件在example/中,ex1.avinput.hg19_exac03_filtered(exac03中没有报道的位点）和ex1.avinput.hg19_exac03_dropped（exac03中报道的位点，包含其等位基因频率）

https://www.jianshu.com/p/84c818207240 https://www.plob.org/article/9976.html

snpEff https://www.bioinfo-scrounger.com/archives/268/

重要 http://www.bio-info-trainee.com/2028.html https://www.jianshu.com/p/cea3b179b8a9

ANNOVAR注释变异VCF结果说明 https://www.omicsclass.com/article/464 https://www.omicsclass.com/article/804 http://blog.sina.com.cn/s/blog_71df25810102ybtt.html

Hui Y, Kai W. Genomic variant annotation and prioritization with ANNOVAR and wANNOVAR[J]. Nature Protocols, 2015, 10(10).