维管植物4

木质素是沉积于维管植物细胞壁中的一类苯丙烷类衍生物，在植物体内木质素含量约为15%~35%(Zhong et al., 2000)。木质素能增强植物体的机械强度，提高细胞运输能力(Whetten et al., 1995)，还可抵御病原微生物的侵害(Duthie et al., 2000)。维管植物木质素的生物合成是适应陆地环境的重要进化特征之一。

木质素结构稳定，很难在短时间内被降解，在造纸工业中需要用大量化学品将原料中的木质素与纤维素分离，分离的木质素等成为造纸工业的主要废弃物。脱木质素的化学药品投入及废液的碱回收处理需大量耗能并增加造纸成本(宋艳茹等，1999)。畜牧业中饲草的木质素影响牲畜的消化与营养吸收。因此，降低木质素的含量或改变其组分，将有利于更好地利用资源植物(赵华燕等，2004)。

4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL，EC 6.2.1.12)位于苯丙烷类衍生物生物合成的分支点上，参与羟基肉桂酸及其衍生物的辅酶A酯的形成(Whetten et al., 1995)。4CL以肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物如4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羟基阿魏酸、芥子酸等为底物，生成相应的辅酶A酯。这些中间产物随后进入苯丙烷类衍生物支路合成途径。其中生成的香豆酰CoA、阿魏酰CoA及芥子酰CoA转化为肉桂醇衍生物，后通过还原反应生成木质素单体(Whetten et al., 1995)。4CL是维管植物木质素生物合成的限速酶之一，是应用基因工程技术调控维管植物木质素含量及组成的关键基因之一。由于木质素重要的生物学功能及其潜在的经济价值，近年来对4CL蛋白及其基因的研究取得了较大的进展。本文对维管植物4CL基因家族、4CL基因的差异表达及其调控、4CL的底物特异性和偏好性、4CL蛋白的结构和功能、4CL基因调控维管植物木质素生物合成等进展综述如下。

到目前为止，已从大豆(Glycine max)(Knobloch et al., 1975)、欧芹(Petroselinum hortense)(Knobloch et al., 1977)、毛果杨与美洲黑杨杂种(Populus trichocarpa×P. deltoides)(Allina et al., 1998)、欧洲云杉(Picea abies)(Lüderitz et al., 1982)、水稻(Oryza sativa)(毕咏梅等，1990)、丝瓜(Luffa cylindrica)(王隆华等，1997)、刺槐(Robinia pseudoacacia)(Hamada et al., 2004)等多种植物中纯化或部分纯化出了4CL蛋白。

Lüderitz等(1982)在欧洲云杉形成层中仅检测到1种4CL同工酶；Voo等(1995)在火炬松(Pinus taeda)木质部中也只纯化出唯一的4CL蛋白。尽管火炬松应压木(compression wood)中H-木质素单体的含量高于正常木材，但没有证据证实在即将形成应压木的木质部中含有不同形式的4CL同工酶(Voo et al., 1995)。更多的研究证实，在大多数维管植物中存在多种4CL同工酶。从欧芹中分离到3种4CL同工酶(Knobloch et al., 1977)，从大豆中分离到2种4CL同工酶(Knobloch et al., 1975)，在刺槐中分离到3种4CL同工酶(Hamada et al., 2004)，在毛果杨与美洲黑杨杂种中分离到3种4CL同工酶(Allina et al., 1998)。

近20年来，编码维管植物4CL的DNA序列和cDNA序列相继被分离出来。已从欧芹(Lozoya et al., 1988)、水稻(Zhao et al., 1990)、马铃薯(Solanum tuberosum)(Becker-André et al., 1991)、毛白杨(Populus tomentosa)(陆海，2002)、火炬松(Zhang et al., 1997)、毛果杨与美洲黑杨杂种(Allina et al., 1998)等植物中分离了编码4CL的基因序列。4CL基因组DNA中均含有内含子，内含子的长度存在差异。从欧芹(Lozoya et al., 1988)、马铃薯(Becker-André et al., 1991)、大豆(Uhlmann et al., 1993；Lindermayr et al., 2002)、毛白杨(陆海，2002)、火炬松(Voo et al., 1995)、美洲山杨(Populus tremuloides)(Hu et al., 1998)、烟草(Nicotiana tabacum)(Lee et al., 1996)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Lee et al., 1995)、紫穗槐(Amorpha friticosa)(刘文哲等，2002；Liu et al., 2002)、紫草(Lithospermum erythrorhizon)(Yazaki et al., 1995)等植物中分离了编码4CL的cDNA序列。

在大部分维管植物中，4CL以基因家族的形式出现。拟南芥4CL由3个基因编码，即At4CL1，At4CL2，At4CL3(Ehlting et al., 1999)。Lee等(1996)从普通烟草中分离出2个编码4CL酶的cDNA克隆，命名为Nt4CL1和Nt4CL2。美洲山杨含有结构上和功能上均不同的2个4CL基因Pt4CL1和Pt4CL2(Hu et al., 1998)。Lindermayr等(2002)从大豆中分离鉴定出4种4CL cDNA基因Gm4CL1、Gm4CL2、Gm4CL3和Gm4CL4，其中前3种4CL基因在结构和功能上均不同，仅Gm4CL4与Gm4CL3高度相似。Kumar等(2003)鉴定了复盆子(Rubus idaeus)的4CL基因家族，分离到3类复盆子4CL cDNA(Ri4CL1，Ri4CL2和Ri4CL3)。Yazaki等(1995)利用马铃薯4CL为探针，从紫草悬浮细胞系中克隆出2个接近全长的编码4CL的cDNA，长度分别为2.1 kb和2.2 kb(Yazaki et al., 1995)。

不同4CL基因在植物中的拷贝数也存在差异。拟南芥中4CL由单拷贝基因编码(Lee et al., 1995)。紫草可能存在3个Le4CL-1拷贝，而仅检测到1个Le4CL-2拷贝(Yazaki et al., 1995)。

尽管从许多植物中分离并鉴定了多个4CL基因，但维管植物中4CL基因家族的大小仍然没有确切的数目。在拟南芥基因组中发现了很多4CL相似(4CL-like)基因，这些4CL相似基因均含有4CL基因的保守序列，但对这些相似基因的功能却研究甚少(Hamada et al., 2004)。杨树作为一种木本模式植物，在其基因组计划完成后，在其基因组中可能也会发现4CL相似基因，相信随着功能基因组学的不断深入，将会逐步确定多种维管植物基因组中4CL基因的确切数目。

早期的研究认为植物的多个4CL基因在苯丙烷类衍生物的不同支路中可能发挥等价的功能。马铃薯中含有2个4CL基因St4CL1和St4CL2，但在马铃薯悬浮细胞中及整个植物组织中2种4CL基因的mRNAs均积聚到相同水平，它们的表达没有明显的差异，2种4CL基因和蛋白在结构上几乎完全一致，使得马铃薯4CL同工酶在代谢通道中不可能具有调控的功能(Becker-André et al., 1991)。

但越来越多的研究表明维管植物的4CL基因成员在植物组织中差异表达。美洲山杨含有结构上和功能上均不同的2个4CL基因Pt4CL1和Pt4CL2，它们在美洲山杨中差异表达。Northern杂交证实Pt4CL1 mRNA在木质化的组织中特异性地表达，伴随着愈创木基-紫丁香基木质素的生物合成；而Pt4CL2 mRNA在茎和叶的表皮层特异性地表达，参与其他苯丙烷类衍生物的形成。二者区室化表达(compartmentalized expression)从而调控不同的苯丙烷类衍生物的生物合成，Pt4CL1参与木质素的生物合成，而Pt4CL2在表皮细胞中参与其他酚类化合物如类黄酮的生物合成(Hu et al., 1998)。在拟南芥中，At4CL1 mRNA在幼苗的根以及成熟植株的抽薹茎中活性最高，At4CL2转录活性在幼苗根中最高；At4CL3 mRNA在花中表达量最高(Lee et al., 1995)。欧芹花茎中4CL mRNA丰度比非生殖茎中的4CL mRNA的丰度高很多(Lois et al., 1992)。毛果杨与美洲黑杨杂种Ptd4CL2 mRNA在幼叶中表达水平最高，在老茎、绿色茎及发育的次生木质部中较低；相反，Ptd4CL1 mRNA在老叶中表达最高，在新叶、绿色茎和木质部中表达较低；4CL1在绿色茎及木质部的表达强度比4CL2的表达强度高(Allina et al., 1998)。复盆子3种4CL基因在不同组织中的转录水平存在差异，在花和果实发育过程中具有不同的表达模式。复盆子4CL基因的调节因子可能是独立进化而来的，不同的Ri4CL基因可能参与不同的生物合成途径，生成不同的苯丙烷类衍生代谢物，从而形成复盆子果实的香味及颜色(Kumar et al., 2003)。

4CL基因家族成员在植物不同组织中的差异表达可能是由于对不同环境因子的反应存在差异造成的。大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)接种大豆悬浮培养细胞10 h后，Gm4CL3/4转录水平达到峰值，而Gm4CL1的转录活性却受到了极大地抑制，接种12 h后，Gm4CL1转录活性仅为对照的10%，Gm4CL2转录水平与对照相比变化很小；大豆疫霉菌游动孢子处理大豆幼苗后不同4CL基因的转录水平也受到相似的表达调控。寄生霜霉菌(Peronospora parasitica)接种拟南芥子叶12~24 h后，拟南芥At4CL1和At4CL2 mRNA被强烈地诱导表达，而At4CL3不被诱导(Ehlting et al., 1999)。RT-PCR测定表明，在照光条件下紫草Le4CL1的mRNA水平通常高于Le4CL2的mRNA水平(Yazaki et al., 1995)。4CL基因有差异地表达，表明它们在植物生长和发育进程的苯丙烷类衍生物代谢中具有不同的功能(Ehlting et al., 1999)。

4CL基因的表达主要受发育调控。4CL基因在植物生命世代中很早即开始表达。拟南芥4CL基因在苗期阶段即被活化，拟南芥发芽后2~3 d，4CL即开始表达，其活性与子叶和根部木质素沉积的起始密切相关(Lee et al., 1995)。烟草Nt4CL2在未着色的烟草花瓣中转录活性很高，表明Nt4CL2 mRNA的聚集受到发育时间的调控(Lee et al., 1996)。毛白杨4CL的表达水平在一个生长季节中呈现“双峰"模式，即“弱—强—弱—强—弱"，分别在6月底至7月初、7月底至8月初达到峰值，与早材和晚材的形成阶段相符合(Zhao et al., 2003)。Reinold等(1993)用原位杂交和GUS的组织化学方法详细研究了烟草花发育过程中4CL1的时空表达规律。用能区别欧芹4CL1转录本和烟草内源4CL1转录本的探针对转入欧芹4CL1的转基因烟草花器官的不同组织进行了Northern杂交，结果表明在花发育的不同阶段，转基因烟草的心皮、花药、花瓣及萼片中4CL的表达量存在差异。杂交的位点与pPc4CL1-GUS表达时空通常一致，表明表达模式由4CL1启动子序列调控，但在部分花瓣中4CL mRNA的积聚与GUS活性缺乏相关性，表明下游序列可能部分介导4CL1的表达发育调控(Reinold et al., 1993)。

4CL基因的表达还能被环境因子激活，如各种伤害、病原菌侵染、紫外线辐射等(Hahlbrock et al., 1989)。伤害胁迫的欧芹根中的4CL mRNA的丰度较高，随着伤害时间的增加，4CL mRNA与PAL mRNA转录水平协同增加，表明二者与苯丙烷衍生物代谢关系紧密。在欧芹的成熟叶片中，4CL mRNA丰度较低，活体及离体叶受到伤害胁迫后4CL mRNA均瞬间高丰度增加(Lois et al., 1992)。欧芹悬浮细胞系在短时间内受到不连续的辐射或用一个从真菌病原菌中获得的激活子处理，活体及体外检测均表明4CL酶合成的速率随时间而发生变化(Lois et al., 1992)。马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)接种马铃薯叶片2 h后，4CL转录活性达到最大值，接种后12 h，4CL酶活性增加2倍，接种后24 h，4CL酶活性恢复为原来的水平；用Pi或花生四烯酸处理马铃薯细胞悬浮液，2 h后4CL转录丰度达到峰值。用致病性强的或无毒性的Pi接种含抗性基因的马铃薯叶片，均得到了相类似的结果(Uhlmann et al., 1993)。紫外线对拟南芥3种4CL基因均能有效激活，紫外线照射6 h后，At4CL1和At4CL2转录活性达最高，紫外线照射后6~24 h，At4CL3转录活性均保持很高水平(Ehlting et al., 1999)。烟草Nt4CL2对于茉莉酸甲酯的转录活性比Nt4CL1的转录活性要低，二者对于伤害的反应水平相对一致(Lee et al., 1996)。Columbia生态型拟南芥的叶片在含致病基因avrB的十字花科(Cruciferae)黑斑病假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. maculicola)株系侵染6 h后，4CL被特异性地活化，产生不协调的交互作用(Lee et al., 1996)；4CL活化的时间与PAL基因表达的时间基本一致。用不含有致病基因avrB的十字花科黑斑病假单胞菌株系侵染，没有造成不协调的交互作用(Lee et al., 1996)。

在植物体内还存在抑制4CL酶活性的物质，对苯丙烷类衍生物的生物合成进行调控。火炬松4CL酶的活性受到辅酶A及苯丙酸衍生物代谢产物如柚皮素(naringenin)和松柏苷(coniferin)等物质的抑制。在春季正在分化的火炬松木质部中松柏苷积累高达木材质量的4.5%，与CAD(cinnamyl alcohol dehydrogenase，肉桂醇脱氢酶)一样，4CL受到松柏苷的反馈抑制。火炬松正常木质部中的蛋白提取物中加入外源的反式-肉桂酸，可使4CL活性受到抑制，阻止转变为咖啡酸，与压缩胁迫下相似(Voo et al., 1995)。Harding等(2002)采用单底物和混合底物测定方法对美洲山杨4CL酶学特性进行了鉴定，发现咖啡酸是其他羟基肉桂酸的竞争性抑制剂，因此在未成熟的木质部Pt4CL1选择性地利用咖啡酸，催化木质素的形成(Harding et al., 2002)。重组烟草4CL1和4CL2及烟草茎抽提物均能以4-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸为底物，且底物特异性相当接近，但2个重组蛋白都可以以肉桂酸为底物，而烟草茎抽提物不能转化肉桂酸。在烟草茎中发现一种热不稳定、高分子(high-molecular-weight)的因子抑制了4CL的肉桂酸活性，表明4CL的底物特异性可能部分地受到细胞中一种类似蛋白成分的影响(Lee et al., 1996)。

在木质素生物合成中，4CL以肉桂酸及其羟基或甲氧基衍生物为底物，生成相应的辅酶A酯。但同种4CL对于不同底物的酶活性存在较大差异。4-香豆酸、阿魏酸和咖啡酸是欧洲云杉和火炬松4CL高效的底物，但它们都对芥子酸没有活性(Voo et al., 1995)。大豆4种4CL重组蛋白对羟基肉桂酸具有高度趋异的催化活性，表明它们在苯丙烷衍生物的生物合成中可能具有不同的功能。研究表明，Gm4CL1和Gm4CL2参与植物生长和发育(包括木质化)、而Gm4CL3和Gm4CL4对环境刺激进行反应(Lindermayr et al., 2002)。经原核表达纯化的美洲山杨的Pt4CL1和Pt4CL2蛋白也具有高度趋异的底物偏好性及底物特异性(Hu et al., 1998)。拟南芥4CL同工酶具有不同的底物偏好性、特异性和不同的表达模式，At4CL1和At4CL2可能参与木质素的生物形成以及除了类黄酮的酚类化合物的生成；而At4CL3可能参与类黄酮的生物合成(Lee et al., 1995)。

从植物中分离的多种4CL同工酶及其重组蛋白均对4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸具有高活性，而对于芥子酸仅具非常低的活性或没有活性，表明芥子醇的生物合成没有经过芥子酸和芥子酰CoA(Allina et al., 1998; Zhang et al., 1997; Lee et al., 1996; 1995)；另外一些研究表明芥子醇苯环5′位置的羟基化和甲基化发生在肉桂醛和肉桂醇阶段(Humphreys et al., 1999; Osakabe et al., 1999)。火炬松(Voo et al., 1995)、美洲山杨(Hu et al., 1998)的4CL均不能以芥子酸为底物；早期从拟南芥中分离的3种4CL同工酶At4CL1、At4CL2和At4CL3均不能转化芥子酸；在4CL基因受到抑制的转基因拟南芥中，抽薹的茎中G-木质素单体下降显著，S-木质素单体的含量在4CL抑制最显著的植株内仍没有变化，因此Lee等(1995)认为在拟南芥中，芥子醇的代谢途径与4CL的活性无关。但Hamberger等(2004)从激活子诱导的拟南芥悬浮培养细胞中克隆出了拟南芥4CL同工酶At4CL4，At4CL4除了可以以4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸为底物外，还具有高效转化芥子酸的能力。Lindermayr等(2002)从大豆中分离了一种4CL同工酶Gm4CL1，它也能够催化芥子酸向芥子酰-辅酶A的合成。在刺槐中，存在组成型表达的转化芥子酸的4CL同工酶。刺槐木质部抽提物经阴离子交换层析分离出3种4CL同工酶，Rp4CL1对4-香豆酸具有极强的偏好性，不能转化阿魏酸和芥子酸；但Rp4CL2和Rp4CL3除对4-香豆酸和咖啡酸具有很高的酶活性外，还具有转化芥子酸的能力。其中Rp4CL2是其中主要的同工酶形式。刺槐嫩枝的蛋白抽提物中也含有相似的4CL同工酶(Hamada et al., 2004)。

Yamauchi等(2003)用同位素标记的阿魏酸和芥子酸饲喂刺槐、夹竹桃(Nerium indicum)、日本辛夷(Magnolia kobus)、拟南芥4种植物后，分析了茎木质部抽提液中4CL的酶活性，研究表明在被子植物中紫丁香基木质素的生物合成是通过多个途径进行的，不同种植物之间紫丁香基木质素的生物合成途径并不相同。在刺槐和夹竹桃中，均检测到了4CL对芥子酸的活性。表明刺槐和夹竹桃可以利用芥子酸生成芥子酰-CoA从而最终合成芥子醇。相反，日本辛夷和拟南芥的4CL不能利用芥子酸。

维管植物4CL同工酶对阿魏酸没有活性也是一个较普遍的现象。如山杨Pt4CL2(Hu et al., 1998)、拟南芥At4CL2(Lindermayr et al., 2002)、大豆Gm4CL2、Gm4CL3、Gm4CL4(Schneider et al., 2003)、刺槐Rp4CL1(Hamada et al., 2004)对阿魏酸均没有活性。

根据4CL蛋白氨基酸同源序列将4CL蛋白分为2个亚组，组Ⅰ和组Ⅱ。其中拟南芥At4CL1和At4CL2，毛果杨与美洲黑杨杂种Ptd4CL1、Ptd4CL2和Pt4CL1归类为组Ⅰ，拟南芥At4CL3及杨树Pt4CL2归类为组Ⅱ。组Ⅰ内的4CL蛋白之间的亲缘关系比它们与组Ⅱ内来自同一种植物的4CL蛋白之间的亲缘关系更为接近，反之亦然。组Ⅱ内拟南芥、杨树和大豆的4CLs主要伴随着类黄酮的生物合成；而组Ⅰ内的4CLs更为主要地伴随着木质素以及其他苯丙烷类衍生物的生物合成(Cukovic et al., 2001)。

在所有已知的4CL氨基酸序列中存在几个保守的肽基序(motif)。肽基序Box Ⅰ，SSGTTGLPKGV，在4CL蛋白序列中几乎绝对保守，而且与荧光素酶、长链脂肪酰基-CoA合成酶、肽合成酶中发现的保守基序相似。肽基序Box Ⅱ，GEICIRG，在所有4CL中绝对保守，其中心的C残基被认为直接参与催化进程(Stuible et al., 2000)。

拟南芥At4CL2具有特殊的底物特异性。它的最适底物不是4-香豆酸，而是咖啡酸，对肉桂酸的转化能力也很低，对阿魏酸和芥子酸没有活性。因此拟南芥At4CL2成为一个适宜的点突变实验系统，通过对At4CL2进行点突变产生“获得功能”(gain-of-function)的突变体。Stuible等(2000)对拟南芥At4CL2进行了定点突变，将Box Ⅱ中保守的C残基突变为A，突变的At4CL2仍具有相当高的酶活性，表明Box Ⅱ肽基序中保守的C残基不太可能直接参与腺苷酸或者硫酯的形成(Stuible et al., 2000)。Ehlting等(2001)运用结构域交换法构建了12个At4CL1和At4CL2的融合表达载体，原核表达获得了融合蛋白。酶学特性鉴定发现At4CL1蛋白Glu283至Tyr420的序列决定了4CL的底物特异性。At4CL1的N末端和C末端序列，分别命名为底物结合域Ⅰ(Sbd Ⅰ)和底物结合域Ⅱ(Sbd Ⅱ)。单独融合其中一个Sbd的At4CL2均能转化阿魏酸；融合At4CL2的Sbd Ⅰ和Sbd Ⅱ的At4CL1则失去了转化阿魏酸的能力。Sbd Ⅰ与细菌肽合酶(bacterial peptide synthesase)腺苷酸亚基的底物结合域相对应，Sbd Ⅱ结构域含有腺苷酸结合酶中的一个保守序列GEI/LxlxG，该序列功能尚未得到鉴定。序列比对发现At4CL1和At4CL2的Sbd Ⅰ中含有9个不同的氨基酸，Sbd Ⅱ中含有4个不同的氨基酸，可能这些氨基酸在底物识别中发挥重要作用(Ehlting et al., 2001)。

Stuible等基于短杆菌肽S-合成酶pheA(phenylalanine-activating)结构域的结晶信息，鉴定了10个可能形成4CL底物结合包(substrate binding pocket，SBP)的氨基酸残基。在这些氨基酸残基中，只有At4CL2中的Met293残基与At4CL1和At4CL3比对是不保守的。将At4CL2中的Met293残基和在蛋白结构预测中位于Met293附近的氨基酸残基Lys320替代为较小的氨基酸(如丙氨酸)，突变的At4CL2能够转化阿魏酸，而对咖啡酸活性没有影响或者仅受到中度影响。而将Met293替换为含苯环的氨基酸后突变体4CL较野生型4CL对咖啡酸的表观亲和性(Km)提高了10倍，但单替换Val294对其酶学特性没有影响。结果表明At4CL2中的Met293和Lys320与酚类底物的3-甲氧基集团可能直接相互作用(Stuible et al., 2001)。

Schneider等(2003)基于PheA的晶体数据，分子模建(molecular modeling)了拟南芥At4CL2的蛋白模型，鉴定了参与At4CL2 SBP的12个氨基酸残基。创造了“功能获得”(gain-of-function)的突变体，通过增加SBP的空间大小产生了具有转化阿魏酸和芥子酸能力的At4CL2突变体，而通过增加SBP的疏水性则产生了能高效转化肉桂酸的At4CL2突变体(Schneider et al., 2003)。

在大豆中存在4个4CL同工酶，它们具有不同的底物特异性。Gm4CL1能够特异性地转化芥子酸，Gm4CL2和Gm4CL3均不能转化芥子酸，氨基酸序列比对表明在Gm4CL1蛋白序列中Pro343和Leu344之间缺失一个保守的Val残基，运用定点突变技术将Gm4CL2和Gm4CL3中保守的Val残基缺失，使得二者均产生了新的底物特异性，突变体均能够转化芥子酸；Gm4CL3野生型蛋白仅能高效转化4-香豆酸和咖啡酸，突变体不仅获得了芥子酸和3，4-二甲氧基肉桂酸的酶活性，而且对阿魏酸的亲和性也得到急剧地提高，表明了该氨基酸对于底物识别中的重要性。表明决定4CL同工酶底物特异性的因素可能是结合沟的空间限制而不是底物和多肽链之间的特异性相互作用(Lindermayr et al., 2003)。

这些研究结果有助于更好地理解苯丙烷类衍生物途径中关键酶的催化行为，对于设计具有新的底物特异性的4CL有所帮助。但都没有从根本上揭示4CL同工酶的底物特异性和偏好性的分子机制。要阐明4CL蛋白结构与其功能的关系，最佳的方法就是获得4CL蛋白的晶体并通过X-衍射或NMR方法收集4CL晶体结构数据，从原子水平上解析4CL蛋白的催化机制。

Hu等(1999)应用反义技术将来自于美洲山杨的基因Pt4CL1用于调控美洲山杨木质素合成。抑制Pt4CL1表达的转基因杨树的木质素下降高达45%，但这种损失由15%的纤维素的增加来补偿，木质素-纤维素总量仍然基本不变，表明木质素和纤维素沉积可以通过补偿方式得到调控。转基因美洲山杨的叶、根、茎的生长得到充分地加强，转基因美洲山杨在细胞水平和整个植株水平上的结构完整性得到保持(Hu et al., 1999)。反义4CL转基因拟南芥的4CL酶活性下降高达92%，其G-木质素含量下降30%(Lee et al., 1997)。Kajita等(1996)将CaMV 35S启动子融合正义及反义4CL基因导入烟草中，均使转基因烟草4CL酶活性下降(Kajita et al., 1996)。在35S启动子融合正义4CL的转基因植株中，茎木质部的细胞壁是褐色的，在褐色细胞壁的木质部内，肉桂醛基和紫丁香基木质素单体含量下降，在有色组织内木质素较正常组织含量低(Kajita et al., 1997)。

我国的科研工作者对4CL基因调控模式植物烟草、毛白杨木质素的生物合成也进行了系统的研究。毛白杨4CL反义基因导入烟草使转基因烟草木质素含量平均下降10.3%，最高可达18.9%，但转基因烟草在开花期存在花瓣开裂现象，而对照植株表现正常，导致转基因烟草表现异常的原因不清楚(Zhao et al., 2003)。抑制内源4CL基因的表达可显著降低转基因毛白杨株系的木质素含量，比非转基因对照下降最高达41.73%，但纤维素含量测定表明，转基因植株与对照没有明显区别，转基因植株茎杆剥皮后呈现程度不等的红褐色，而对照为白色，其他生长发育与对照无明显差异(贾彩红等，2004)。组成型启动子CaMV 35S及形成层定位表达启动子GRP1.8和Pto4CL1启动子融合毛白杨正义及反义4CL1基因分别导入烟草，通过对转基因植株和对照植株的纤维素和木质素含量的对比分析，发现35S启动子反义4CL1转基因烟草的纤维素含量比对照提高了11.4%，而木质素含量比对照降低了19.1%(杨雪萍等，2003)；GRP1.8启动子反义4CL1转基因烟草的木质素含量较对照平均下降了13.7%，而转基因植株的纤维素含量较对照升高了15.6%(赵艳玲等，2003)；高效液相色谱方法测定木质素生物合成中间代谢物4-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸的含量，发现转入35S-反义4CL1的转基因烟草中4-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸的含量分别是未转化植株的2.5倍、2.9倍、7.4倍；GRP1.8-反义4CL1融合基因转基因烟草4-香豆酸、阿魏酸、咖啡酸的含量分别为未转化植株的2.7倍、2.8倍、6.6倍，表明转入的反义4CL基因抑制了烟草内源4CL的表达，降低了烟草内源4CL蛋白的酶活性，从而使4CL的代谢底物在体内得到积累(陶霞娟，2003)。CaMV启动子35S正义融合4CL1转基因烟草叶片中4CL酶活性提高4~5倍，茎中4CL活性提高1~2倍，叶片中木质素含量增加20%，茎部木质素含量增加25%；sjGRP1.8正义4CL1转基因烟草中叶片4CL酶活性未见增加，而茎4CL活性提高1~2倍，叶片木质素含量与未转基因植株没有差异，而茎部木质素含量增加25%(Lu et al., 2003)。Pto4CL1正义转基因烟草叶片及茎部的酶活性和木质素含量分析也得到了极其一致的结果(Lu et al., 2004)。表明毛白杨4CL1基因在2种维管组织特异表达的启动子调控下特异性地在维管组织表达，2种维管组织特异表达的启动子将在维管植物木质素改良基因工程中发挥越来越重要的作用。

模式植物拟南芥中已经鉴定出4种4CL基因的功能，但在拟南芥基因组中还存在许多4CL相似基因，这些4CL相似基因的功能是什么？木本植物如杨树中含有多少个4CL基因？它们的确切功能是什么？这些问题还尚未完全搞清楚。但随着杨树基因组计划的完成以及蛋白质组学、分子标记技术、基因芯片技术的不断完善，相信会分离并鉴定出更多木本植物的4CL基因。

木质素生物合成关键酶4CL在维管植物中多以基因家族的形式出现，因此欲以反义技术或RNAi技术来抑制4CL基因的表达，应该尽量选择与其他基因同源性较低的4CL基因片断，以免植物正常代谢受阻。目前通过基因工程手段调控木质素生物合成的研究主要应用于降低木质素含量上，尚未见到通过生物技术来增加木本植物木质素含量的研究报道，这方面的研究值得关注。

近几年来，国际上有几个实验室同时对4CL的结构与功能关系进行了深入的研究，获得了一系列有关4CL结构与功能关系的信息。但要从根本上阐明二者之间的关系，最根本的方法仍然是建立4CL蛋白适宜的结晶体系，获得4CL蛋白的晶体并通过X-衍射或者是NMR方法收集4CL晶体结构数据，从原子水平解析4CL蛋白的结构，从而阐明二者关系。范丙友等(2006)构建了我国乡土树种毛白杨4CL1基因的原核表达载体，在大肠杆菌中成功表达了有生物活性的重组4CL1蛋白，应用金属螯和亲和层析技术获得了电泳纯的毛白杨4CL1重组蛋白，作者所在实验室与中国科学院生物物理研究所合作正在对该蛋白进行结晶体系研究。