棉花U6启动子克隆与功能分析及拟南芥GGB突变体的创制

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作者：

雷建峰

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摘要：

CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物功能基因组学和作物分子育种研究中展现了广阔的应用前景,目前已在多种农作物中成功得到应用,但是用于棉花的CRISPR/Cas9基因编辑技术体系还未见报道。U6启动子是构建CRISPR/Cas9基因组编辑技术中驱动sgRNA转录的重要元件,而棉花基因组中预测至少有10种U6 RNA对应的U6启动子,它们是否具有转录动能,能否在棉花生殖细胞高效转录都并不清楚;另外前人研究表明拟南芥GGB基因突变失活后,抗旱性明显增强。二倍体棉花基因组中具有一个单拷贝的拟南芥GGB的同源基因,该基因是否与拟南芥GGB基因功能相似,是否可以作为棉花抗旱育种的一种理想靶标基因。最可靠的证据来自于棉花GGB基因是否能功能互补拟南芥ggb突变体的表型。为此,本研究开展了两方面的工作,首先克隆棉花多个候选U6启动子并进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9基因组编辑载体提供理想的启动子;同时利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得拟南芥ggb突变体,为验证棉花GGB基因的功能提供理想的互补转基因受体材料,为最终利用棉花CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除棉花GGB基因,获得无转基因成分的抗旱棉花新材料奠定前期基础。主要研究结果如下:1.从海岛棉新海16中克隆了5种GbU6启动子,启动子长度分别为1 166、1 119、1 134、1 214和1 176 bp,并构建获得相应5种GbU6::GUS融合表达载体;对拟南芥和克隆的5个GbU6启动子进行序列比对,发现GbU6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的-60 bp位置的USE元件和-30 bp位置的TATA框;将GbU6::GUS的DNA片段利用基因枪轰击法转化棉花花粉,结果显示克隆的5个GbU6启动子有4个能驱动GUS表达,棉花花粉被染成蓝色。其中GbU6-5P::GUS的染色相对较深,接近于CaMV35S启动子。2.对已克隆的GbU6-5P启动子进行有效截短,成功克隆出6个长度不同的U6启动子,大小分别为:672、468、358、280、202和105 bp,并分别构建了6个启动子驱动GUS的融合植物表达载体;农杆菌真空渗透转化棉花花粉结果显示:克隆的7个不同截短大小的GbU6-5Ps启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录,棉花花粉被染成蓝色,但颜色深浅存在显著差异。启动子长度越短,其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和Gb U6-7P也表现出类似的结果。研究结果显示较短U6启动子其转录活性较高,而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。3.将构建好的带有GGB基因靶序列的编辑载体利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥。对转基因后代GGB基因的测序结果分析发现,在靶位点处有缺失4个碱基和增加1个T碱基的突变体产生。分别对野生型拟南芥和ggb突变体进行半定量RT-PCR分析,结果显示突变体材料中几乎检测不到GGB基因的表达,说明获得的拟南芥ggb突变体为GGB基因敲除突变体。对野生型和ggb突变体叶片失水率、耐旱表型及单株种子量测定结果表明,拟南芥GGB基因突变后,叶片失水速率显著降低,抗旱性明显增强,而单株种子量却没有明显改变。

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关键词：

棉花；CRISPR/Cas9；GbU6启动子；基因敲除；ggb突变体；抗旱性

学位级别：

硕士

DOI：

CNKI:CDMD:2.1016.239754