【收藏】CRISPR/Cas 植物基因组编辑技术

01 CRISPR/Cas 免疫系统的作用机制和分类

科学家们对CRISPR/Cas免疫系统的研究早在30 年前就已经就开始。1987 年，日本研究团队在研究大肠埃希菌 Escherichia coli 碱性磷酸酶的同工酶基因 iap 的时候发现，在该基因的 3＇端存在特殊的侧翼结构，即 29 bp 的高度相似序列分别被 32 bp序列间隔，形成了 5 个拷贝的串联重复序列[3]。但该团队并未对此现象进行更深入的研究。Mojica等[4-5] 对此产生了浓厚的兴趣，他们利用生物信息学检索探究，在 20 多种微生物中都发现了类似的短序列重复结构，并将这种短序列重复结构命名为规则的短间隔重复(Shortregularly spaced repeats，SRSRs)；提出 SRSRs 可能存在于原核生物基因组，包括所有嗜热细菌和古细菌中以及部分的蓝藻和变形菌门生物；总结了SRSRs的基本特征：24~40 bp 的短回文序列 (回文区可达 11 bp) 成簇存在，并被非重复的 20~58 bp 序列间隔开来。2002 年，为了更贴切地表示 SRSRs 的特征以及避免命名的混乱，Jansen 与 Mojica 商定将 SRSRs 更名为成簇有规律的间隔短回文重复序列 (Clusteredregularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)。Jansen 等[6] 发现大部分种类的原核生物具有 2 个或 2 个以上的 CRISPR 基因座前导序列，而这些CRISPR 基因座前端共享一个 300~500 bp 的种间保守前导序列，并通过比较 CRISPR 基因座侧翼的基因组信息，鉴定出不同原核生物中高度相似的4 个 CRISPR 关联基因：Cas1~Cas4。2005 年，Mojica等[7] 再次发表了对 CRISPR/Cas 系统研究的最新结果，他发现 CRISPR 中的间隔序列大部分来自噬菌体或接合质粒，并且携带某一噬菌体片段的细菌具有对相应噬菌体的抵抗力；CRISPR 基因座存储了病原菌的基因信息，可能是微生物适应性免疫系统的一部分。随后，另有2个科研团队也发表了相近结果的论文[8-9]。2007 年，Barrangou 等[10] 证明了在噬菌体攻击后，筛选到的抗性细菌的 CRISPR 区整合了新的间隔序列，而间隔序列正是来源于噬菌体DNA，也就是说，细菌通过识别与噬菌体序列相同的 CRISPR 间隔区对应的特定序列，获得对噬菌体的抗性，产生适应性免疫能力；还确认了CRISPR关联基因 Cas7 帮助细菌获得新的间隔序列和重复，Cas9 则发挥了核酸切割酶的作用，为细菌免疫系统所必需。随后的几年，CRISPR 细菌免疫系统的必要条件和作用机制相继被发现和证实，如CRISPR 中依靠重复序列形成的 crRNA 是 CRISPR产生抵抗力的关键[11]，Cas9 切割的对象是 DNA[12]，且对 DNA 的精准切割的位点与 crRNA 特定序列和 PAM(Proto-spaceradjacent motif) 序列有关[13-14]，Ⅱ型系统中 tracrRNA 也参与了 Cas9 的切割[15] 等等。

CRISPR/Cas 系统广泛分布于 90% 的古细菌及 50% 的细菌基因组或质粒上[16]。它由 CRISPR基因座和 Cas 基因 2 部分组成，其中，CRISPR 基因座又包括位于 CRISPR 基因座上游富含 AT 碱基的前导序列 (Leader)、涵盖回文序列的 20~50 bp 的重复序列 (Repeat) 和从外源捕获的间隔序列 (Spacer)。CRISPR/Cas 系统的免疫过程分为 3 个阶段[17]：1) 外源 DNA 首次入侵时，细菌进入适应阶段，来源于噬菌体或质粒上的前间隔序列(Protospacer)的 DNA同源短片段被整合到 CRISPR 基因座前导序列下游中，形成新的间隔序列；2) 外源 DNA 再次入侵时，细菌激活了表达阶段，CRISPR 基因座转录出前体crRNA，由内切核糖核酸酶催化加工成成熟的crRNA；3) 在干扰阶段，成熟的 crRNA 引导 Cas 蛋白复合物靶向噬菌体前间隔序列位置，识别噬菌体基因组内的 PAM 序列，对外源靶标位置精准切割从而避免细菌切割自身 CRISPR 基因座。

2012 年，Jinek 等[15] 在《Science》上发表研究成果，证明了 crRNAs (CRISPR RNAs) 与 tracrRNA (Trans-activatingcrRNA，反式作用crRNA) 配对结合后形成双分子的RNA结构，可以介导 Cas9 蛋白定向切割 DNA 序列。2013 年，张峰团队率先利用CRISPR/Cas9 技术在人类和小鼠细胞内实现了精准的基因编辑，并构建了可同时靶向多个位点的基因编辑系统[18]。此后，CRISPR/Cas 基因编辑技术蓬勃发展。

Makarov 等[17, 19] 根据 Cas 基因的数目和功能将 CRISPR/Cas 系统分为了 2 大类 5 种类型 (Ⅰ ~Ⅴ)16 种亚型，其中，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型属于第 1 类，它们在干扰靶基因时需要多个Cas 蛋白形成复合物协同工作；Ⅱ和Ⅴ型属于第2 类，它们利用单一Cas蛋白就能够干扰靶基因。第2 类Ⅱ型系统较为简单，研究也更加透彻，目前应用较广的 CRISPR/Cas9系统为Ⅱ 型CRISPR 系统，而新兴的 CRISPR/Cas12a(Cpf1) 系统属于Ⅴ 型CRISPR 系统。Shmakov 等[20]2015 年又发现了Ⅵ和Ⅴ型的 2 种亚型。

01 CRISPR 基因编辑系统的建立

在对细菌的CRISPR/Cas 免疫系统及作用机理有了较深的认识后，科学家们开始对该系统进行改造并应用于动植物的基因组编辑。目前应用最广泛的 CRISPR 基因编辑系统主要包括CRISPR/Cas9系统和 CRISPR/Cas12a 系统。

CRISPR/Cas9 系统的建立

CRISPR/Cas9 是目前报道的唯一被优先应用于基因编辑的Ⅱ型系统。与Ⅰ和Ⅲ型 CRISPR 系统需要多个 Cas 蛋白形成复合物共同发挥功能的机制不同，Ⅱ 型 CRISPR 系统仅需 1 个 Cas 蛋白和 2 个RNA 元件即可实现对靶 DNA 的切割[15]。为了进一步简化 CRISPR/Cas9 系统，研究者通过保留必需元件 tracrRNA 和 crRNA的核心序列并引入连接区，将两者合并为一个sgRNA(Single guide RNA)，并通过体外试验证实 Cas9蛋白能在 sgRNA 的引导下切割双链DNA，这一系列成果为 CRISPR/Cas9 在基因编辑中的广泛应用奠定了坚实基础。自 2013年起，利用 CRISPR/Cas9 技术相继实现了对人类细胞、小鼠细胞、斑马鱼、果蝇、水稻、拟南芥等真核系统中的內源基因组编辑[21-31]。

CRISPR/Cas9 基因编辑技术主要包括两大核心内容：1) 构建 Cas9/sgRNA表达载体，将载体导入受体细胞表达发挥编辑作用；2) 将表达纯化的Cas9蛋白与合成的 sgRNA 导入受体细胞发挥编辑作用。来源于链球菌 Streptococcus pyogenes 的Cas9 蛋白 SpCas9最先被应用于基因编辑，该蛋白含有一个RuvC-like 结构域和一个 HNH 核酸酶结构域，两者分别在靶 DNA 的 PAM 序列“ NGG”上游 3 nt 处对 DNA 双链进行切割，形成平末端。在真核系统中，需要在 Cas9 蛋白中添加一段核定位信号以保证该蛋白进入细胞核正常发挥功能。sgRNA是一段具有特定结构的单链 RNA，其5＇端约2 0 个碱基与靶 D N A 互补配对结合，引导Cas9/sgRNA复合物对相应位点进行切割，决定编辑位点特异性。因此，在构建Cas9/sgRNA 表达载体编辑受体基因组中不同的位点时，只须改变sgRNA 中 5＇端的特异位点识别序列，而其他元件可保持不变，极大地降低了载体构建的技术门槛。此外，通过构建多个sgRNA 表达盒的串联载体，可实现同时对多个靶位点的有效编辑，显著地提高了该系统的编辑效率。在 Cas9/sgRNA 表达载体构建完成后，需要通过多种转化手段将表达元件或Cas9/sgRNA产物导入到编辑受体中发挥功能。在植物系统中，将Cas9/sgRNA表达载体导入植物细胞的有效方法包括原生质体 PEG 转染、农杆菌叶片注射法、基因枪轰击、农杆菌介导转化等，不同方法在不同植物中的编辑效率各异[32-34]。在此基础上，不同实验室针对植物系统影响编辑效率的关键因素如 sgRNA序列、启动子选择、Cas9 变体或同源蛋白的选择等进行了一系列探索和优化[32, 34-36]。

CRISPR/Cas12a 系统的建立

虽然CRISPR/Cas9 被广泛应用，但该系统仍存在编辑位点受限、脱靶情况较多等缺陷，因此开发与建立新的 CRISPR基因编辑系统是科学家们研究的热点之一。CRISPR/Cas12a 属于Ⅴ 型CRISPR/Cas系统，它同样只需一个 Cas 蛋白即可对双链DNA 进行切割，但其作用元件和作用模式与 CRISPR/Cas9截然不同[37]。首先，仅携带 RuvC-like 结构域的 Cas12a 在 crRNA 引导下即可切割双链 DNA，不需要 tracrRNA 的参与；其次，C12a 特异识别富含T 的 PAM 序列；最后，Cas12a 在靶 DNA 的 PAM序列下游 18 nt 处 (正链) 和 23nt 处 (负链) 对DNA双链进行切割，形成黏性末端。与CRISPR/Cas9 相比，该系统具有如下独特优势[ 3 8 - 3 9 ]：1)CRISPR/Cas12a系统的 crRNA 比 sgRNA 更短，且 Cas12a蛋白也比 Cas9 蛋白更小，因此，CRISPR/Cas12a 适用于更多装载量小的载体系统，特别是多靶点编辑的情况；2)Cas12a 切割 DNA 后形成黏性末端，增加了 HDR 修复途径发生的概率，有利于 DNA 片段的定点插入和替换；3) 在多个物种的基因编辑中，CRISPR/Cas12a 表现出更低的脱靶率。

目前，CRISPR/Cas12a 在基因编辑中的应用仍局限于少数物种，植物的研究大部分集中在水稻系统[40-47]以及少数烟草、拟南芥、大豆和玉米等系统的报道[40, 43, 47-48]。这可能是因为CRISPR/Cas12a 在低温条件下编辑效率低[47]，且较严格的 PAM 序列“TTTV”降低了该系统的编辑范围。基于其自身的优点及局限性，CRISPR/Cas12a 成为了继 CRISPR/Cas9 后第2 个被广泛关注的基因编辑系统，两者互为补充，进一步丰富了基因组编辑系统选择的多样性。

CRISPR/Cas9 在植物基因组编辑中的应用

目前CRISPR/Cas9 在植物基因组编辑中的应用主要包括基因功能研究和作物遗传改良，编辑形式可分为功能基因的敲除、基因 (片段) 的定点插入或替换、单碱基编辑和基因表达调控4 个方面。

3.1 功能基因的敲除利用

CRISPR/Cas9 对功能基因进行特异敲除是目前该系统在植物中应用最广泛的方向。这是由于Cas9蛋白切割目标 DNA 形成双链断裂后，往往会优先启动编辑受体中的 NHEJ 易错修复途径，大多数情况下可以在切割位点附近产生碱基并插入缺失(Indel)，且大部分是 1 bp 的插入、小部分为短片段缺失[49-50]。当产生的 Indel 位于基因外显子且碱基数不是 3 的倍数时，便会造成密码子的移码突变。对于二倍体植物如水稻，由CRISPR/Cas9 产生突变的效率能达到 80%以上[51]。当 2 个等位基因同时被编辑产生双等位突变或纯合突变时，便能实现基因的敲除。对于多倍体植物，所有等位基因同时被编辑的概率偏低，因此多倍体植物特别是小麦、土豆等农作物的高效编辑体系构建仍是当前研究的难点[52-53]。

基于CRISPR/Cas9 系统介导基因敲除的高效性，多基因编辑技术随即诞生。多基因编辑主要有2条途径：1) 对多个同源基因同时进行敲除，此时只需以它们的保守序列作为靶点，设计一条sgRNA即可敲除多个基因，但该方法使用范围受限；2) 对不同基因设计针对不同靶点的sgRNA，将多个 sgRNA表达盒连接到表达载体并导入编辑受体，如在水稻中能实现 7 个基因的同时敲除[50]。这种多靶点编辑技术特别适用于功能冗余基因、基因家族和同一生化途径中多个基因的功能研究，以及农作物中多个农艺性状的改良。此外，多靶点编辑技术还能通过在基因片段两侧各设计一个靶点，实现片段的删除。目前利用该方法可成功删除大于100 kb 的染色体片段，而对于 1 kb 以内 (特别是