What？我的转基因植株又没表型

利用sRNA的 传递性（Transitivity，是指初级sRNA在特定DNA区段的聚集会导致RDRs的富集，产生dsRNA，进而在临近区段形成二级siRNA，这种沉默范围扩大的过程就被称为传递或者二级RNAi效应），作者们设计了一套可以检测“自我”和“非我”对传递敏感性差异的报告系统（图1a）。该系统基于一种可以产生靶向内源CHALCONE SYNTHASE（CHS）基因中央“H”区域的hpRNA的Hhp设计，Hhp可以与融合了CHS基因“S”区段的GFP（GFP-S）共表达（图1a）。在转基因株系中，Hhp转录后产生的siRNA可以靶向内源的CHS，这样的话靶向''S"位点的siRNA就不会产生，也就不会造成''S"区域的传递siRNA，转基因株系中就可以观察到GFP发光。但如果拮抗内源传递性的基因发生突变，GFP的表达就会由于“S”位点的传递性siRNA的产生而被抑制，从而观察不到GFP荧光的产生。将这一转基因系统EMS诱变后筛选GFP表达降低或者没有GFP表达的突变，就可以用来探究外源转基因沉默的可能机制。利用这套系统筛选到了6个GFP信号变弱或消失的群体，有意思的是，所有4个发育正常材料的突变基因都与转录终止相关，PCFS4, CSTF64和CPSF73-I均参与mRNA 3’末端的形成，DCL4除了与RNA沉默相关外，还参与共同转录以抑制转录的通读。 这些结果强烈地暗示，转录终止在保护基因免于沉默这一过程中起着关键作用。

图1 EMS筛选以鉴定涉及转基因沉默的元件

之前曾有研究显示，不同的基因组件，例如启动子和内含子等对转基因稳定性都有一定影响。在作者筛选到的突变材料中，终止子也是影响转基因表达水平的一个重要影响因素。为了研究各个元件对转基因稳定性和表达量的影响，如图2a所示，作者们设计了一套包含不同启动子和终止子的GFP报告系统。报告系统中用得完启动子为花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子（p35S）或拟南芥RuBisCO小亚基（RBCS1A，AT1G67090）5'启动子区（pRBCS），与它们组合的终止子来自于基因（i） 根癌农杆菌的NOPALINE合成酶（NOS），拟南芥的（ii）RBCS1A或（iii）HEAT SHOCK PROTEIN 18.2（HSP18.2，AT5G59720）（分别命名为tNOS，tRBCS和tHSP）。因为之前有报道显示，RBCS1A的启动子和终止子与剪切因子结合时对基因的表达具有一定效应，因此作者也构建了一套对应的包含RBCS1A的两个内含子的报告系统（图2a）。在加入或不加入viral suppressor of RNA silencing (VSR) P19（P19可以结合21nt的sRNA，阻止PTGS）的情况下，将上述报告系统通过瞬时转化方法转入烟草叶片。 结果显示，在使用tHSP终止子的时候，GFP的荧光最强，之后是tNOS，而tRBCS终止子即使是在P19存在时表达也非常低或者不表达（图2b）。 内含子剪接对GFP表达的结果是多样的，与tHSP一起使用时，内含子对荧光有轻微的正向作用，相比之下，GFP的表达受到内含子与tNOS组合的显着影响，与无内含子相比，有内含子时荧光水平下降了50％以上（图2b和2c）。

图2 烟草叶片瞬时表达，测试不同因子对GFP表达和稳定性的影响

上一部分结果说明，终止子的使用与否在很大程度上影响了GFP的表达。这种差异可能是由靶向转基因的siRNA积累模式不同导致的。检测结果显示，具有tHSP终止子的转化载体几乎检测不到GFP-衍生的siRNA，而在表达tNOS或tRBCS为3'调控序列的报告基因的所有样品中，都可以稳定检测到与GFP匹配的siRNA（图3a）。在pRBCS和p35S启动子的3'末端也可以检测到siRNA的积累（图3a）。这些结果说明， 很可能是RDR6的活性将siRNA产生扩展到了启动子区域。

终止子依赖的siRNA的积累可能是由转录终止效率和准确性不同造成的，超出规定终止位点的 转录通读（ read-through）会产生缺少poly（A）尾巴的mRNA，这类mRNA可以吸引RDR6，产生siRNA。为了验证这一假设，作者利用RT-qPCR方法检测了瞬时转化的烟草叶片中转录通读的比例（图3b），结果显示， 在所有的报告载体中，只有包含tRBCS的载体具有显着的通读水平，这造成了高剂量siRNA的积累，也解释了为什么在tRBCS调控下，GFP荧光亮度较低（图3b）。然而，仅仅转录通读并不能解释tNOS和tHSP之间的差异，因此，它们不同的表现可能是另一种分子机制的结果。

进一步检测内含子剪切效率发现，在tNOS具有内含子的转化样品中，可以检测到加工和未加工的转录本（图3c），在加入P19后这内含子剪接问题就检测不到了，这说明 这种内含子保留是由siRNA触发的（图3c）。

图3 农杆菌侵染叶片的分子特征

尽管GiFiP::tNOS转化材料中内含子剪切有缺陷，但细致分析发现第二个内含子区域的保留的比例相对一第一个内含子来说更高一些。为了进一步研究造成这种差异的原因，作者又构建了如图4a所示的融合载体。GiFP和GFiP的比较发现，仅携带第二个内含子的载体（pRBCS::GFiP::tNOS）表现出了与GFP低表达相关的特性，例如剪接缺陷和较高水平的siRNA（图4b-e）。进一步地， 发现只有在靠近终止子的位置含有内含子的载体才会有GFP表达降低，剪接缺失和siRNA积累增加的表型（图4b-e）。

图4 内含子对瞬时转基因表达水平的影响

鉴于tRBCS,tNOS和tHSP对转基因稳定性和表达的不同效应，考虑到终止子在转录和poly（A）尾巴形成过程中的作用，作者使用circularRT-PCR（cRT-PCR）对tRBCS，tNOS和tHSP的poly（A）位点进行了检测。结果显示，tHSP可以鉴定到固定的poly(A)位点，但tNOS中没有传统的poly（A）信号，结合之前的数据， 作者推测终止子能够保护转基因免受siRNA沉默的能力与精确的poly（A）位点的相关（图5a,b）。

图5 poly（A）尾巴特征分析

基于本研究及之前的结果，研究人员 在设计转基因载体元件时，为了获得最佳表达，载体应具有较强的终止子，以避免产生异常的转录本（图6b）。强终止子的定义是它能促进转录精确终止，从而降低未聚腺苷酸转录物的水平和防止siRNA的产生。如果在转基因过程中使用了一个有缺陷的终止子（例如tRBCS）则会产生末端不正确的转录本，具有多个切割位点和许多未聚腺苷酸化的位点。这将导致RDR6富集，siRNA产生和基因沉默效应（图6c）。终止子的使用（如tNOS）可能会导致转录产物具有定义不清的poly（A）位点，这也是导致转基因产生siRNA的另一个重要原因（图6d）。 另一个影响转基因稳定性的因素是内含子的存在，在大多数情况下，让转录本不通过剪切可以保护其被RDR6加工（图6e）。但当内含子与某些终止子（例如tNOS）组合时，内含子可以充当siRNA产生的催化剂（也取决于内含子在mRNA中的相对位置）（图6f）。这样一来，sRNA不仅促进了基因沉默，还可能干扰内含子剪接，而内含子的保留导致了功能缺失蛋白的产生（图6c,f）。

图6 导致转基因衍生的siRNA积累的不同情况

最后再说两句：本文的研究结果对于我们转基因载体构建，特别是超表达载体的构建具有一定的指导意义，下次在构建载体之前，可以先考虑一下自己载体上各种调控元件是否为最优组合。如果转基因不表达，也可以从这几个方面找原因。

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