蛋白类药物的糖型分析

N-糖链（由天冬酰胺连接寡糖）结构分析包括寡糖链释放、标记、液质联用分析和数据处理四个步骤。寡糖链释放根据不同的糖基化类型选择不同的方法，N-糖链主要使用PNGase F。衍生化标记步骤可以增强寡糖的质谱响应。其中，还原末端标记2-AB等苯胺或杂环化合物还可使寡糖链通过荧光检测，全甲基化标记增强寡糖链的疏水性，实现反相分离检测。以Q-Exactive为代表的Orbitrap超高分辨质谱具有高的灵敏度优势，使用其直接分析未标记的糖链也可以取得满意的效果。寡糖碎片质谱可使用软件进行全自动结构解析，获得寡糖链精细结构信息。

N-糖基化位点鉴定通常使用PNGase F 酶释放糖链，使肽段上产生去糖基化位点，并在肽段上产生去糖基化痕迹：天冬酰胺(N)发生脱氨基化，造成0.9840 Da的质量增加。通过质谱寻找发生+0.9840 Da的天冬酰胺，以及N-糖基化保守序列NXS/T (X代表脯氨酸以外的任何氨基酸)过滤，获得可信的鉴定结果。为了避免天然脱氨基化造成的假阳性，可以在18O水中进行酶切，使去糖基化位点含有一个18O，形成+2.9890Da，可与天然脱氨基区分。

糖基化位点的发现与确证对质谱的分辨率与灵敏度具有较高要求。Orbitrap由于具有超高分辨率和超高灵敏度，无论对于单抗等纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品，都是是糖基化位点表征的最佳工具。目前糖基化位点最大的数据集，共从小鼠组织与血浆中注释了6367个糖基化位点。该实验采用用PNGase F 释放糖链并标记18O方法，使用Orbitrap鉴定糖基化位点，共鉴定到6367个位13点，其中5753个位点是没有记载的新位点。该研究对糖蛋白的研究具有重要意义，也展示出了Orbitrap超群的性能。在相对简单的抗体及其他蛋白药物糖基化位点表征中，Orbitrap更可毫无疑问地胜任此工作。

糖肽分析前处理简单，能同时鉴定糖基化位点和解析寡糖链结构，并获得位点特异性糖链信息，即微观不均一性。但是糖肽解析比糖链与糖肽分开解析的传统方法更为复杂：寡糖链离子化效率较低；相比肽段骨架更易碎裂，造成肽段骨架难以充分碎裂；谱图非常复杂，传统搜库手段无法处理。HCD高能碎裂相比传统CID能获得更丰富的碎片信息，使糖肽的寡糖链和肽段骨架充分碎裂