【血清中和抗体】（超细的操作，个人实操版）

1) 血清和细胞准备

采血后，分离小鼠和猪只血清，将装有新鲜血液的针筒斜放在37℃温箱，静置1h，后4℃过夜静置，取上清，1000rpm离心30min；获得无明显溶血的血清，经56℃水浴锅灭活30 min后，用于后续试验。

将状态良好的Marc-145细胞提前一天消化，并将其均匀铺在96孔板细胞培养板上。细胞密度的选择是将1个细胞培养小瓶铺到1.5个96孔板细胞培养板，第2天，查看Marc-145细胞状态，等细胞长满单层，状态良好，方可进行下一步试验。

2) 血清稀释

选择1.5ml EP管，2倍比稀释血清，考虑到PRRSV的疫苗免疫后效价一般不是特别高，稀释度阈值设置1:32，按照1:4、1:8、1:16、1:32进行稀释，具体操作如下，取125ul血清加入到375ul的2% FBS的DMEM中，涡旋仪涡旋5s，后瞬时离心3s，此时血清稀释倍数1:4；取刚刚EP中的稀释液250ul 加入到250ul的2%FBS的DMEM中，涡旋仪涡旋5s，后瞬时离心3s，此时血清稀释倍数1:8；逐级稀释，同上。

病毒稀释（WUH3病毒效价107.5/ml，计算200TCID50稀释倍数为15000）

病毒提前从-80℃冰箱取出，自然融化后，4000rpm离心30s；配制200TCID50：10倍比稀释操作如下，取100ul病毒液加入到900ul 2% FBS的DMEM，涡旋仪涡旋5s，后瞬时离心3s，此时病毒稀释倍数为10，再取刚刚EP中稀释液100ul 加入到900ul的2%FBS的DMEM中，涡旋仪涡旋5s，后瞬时离心3s，此时病毒稀释倍数为100；再取刚刚EP中稀释液1ml 加入到9ml的2%FBS的DMEM中，涡旋仪涡旋5s，后瞬时离心3s，此时病毒稀释倍数为1000；取2ml加入到38ml 2%FBS的DMEM中，此时病毒稀释倍数为20000，此时对应的病毒稀释倍数为200TCID50；后依次设置病毒对照20TCID50、2TCID50、0.2TCID50，操作方法是取200TCID50病毒液，10倍比稀释；稀释好的病毒液准备好备用。

4) 血清与病毒的中和

将2和3中准备好的血清和病毒混合，具体操作是将1.5ml EP管中分别加入250ul血清及250ul病毒（200TCID50），涡旋仪涡旋5s，后瞬时离心3s，将EP管架放入37℃温箱，静置1h。

5) Marc-145细胞的病毒感作

取1中准备好的96孔板细胞培养板，甩掉培养基，使用PBS清洗1~3遍，随后将4中血清与病毒的混合物加到96孔板细胞培养板上，每孔100ul，放入37℃温箱，静置1.5h。

6) 感作后Marc-145细胞的维持培养

弃掉5中液体，使用PBS清洗1次，注意枪头不要戳到细胞板，随后加入200ul 2%FBS的DMEM，维持细胞培养。

7) 中和抗体效价判定

每天取出96孔板细胞培养板，显微镜下观察各孔细胞感染情况，按照以往的经验，72h的Marc-145细胞病变呈现菊花样，96h的Marc-145细胞开始崩解碎掉，96h后Marc-145细胞病变稳定可以进行中和抗体的判定。逐天观察并记录CPE情况，直至结果稳定。在对照成立条件下，按Reed-Muench两氏法计算被检血清抗PRRSV的特异性中和抗体的滴度，以能够完全保护细胞不发生病变的血清最高稀释倍数作为该被检血清样品的中和效价。