三氟乙醇和Zn2+对α

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作者：

曾艳飞

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摘要：

目的和意义 环境污染伴随着工农业生产的发展而出现.研究表明,糖尿病发生除了观察到胰岛素分泌不足或胰岛素拮抗直接导致的作用外,由遗传,环境,行为等因素的共同作用也不容忽视.α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)为世人所认识的是其与临床2型糖尿病有关,而这种酶的抑制剂则与2型糖尿病的治疗相关.而口服抗糖尿病药物,通过抑制α-葡萄糖苷酶的作用而影响碳水化合物的吸收,对糖尿病治疗起着关键调节的作用.开展对α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究,不仅具有生物与医疗方面的价值,也与环境污染的相关研究有着密切的联系. α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)水解α-葡萄糖苷酶非还原端末端1-4α-连接的D-葡萄糖的残基,最后一步是消化碳水化合物,a-葡萄糖苷酶活性与血糖水平直接相关.由于它在二型糖尿病患者葡萄糖的吸收中具有潜在的下调作用,因而具有重要的临床意义.有几种类型的α-葡萄糖苷酶抑制剂被报道过,包括基质类似物,生物碱类,酚类物质,姜黄素类化合物和天然原料中的花青素.这些抑制剂治疗通常是用来口服的.它的通过抑制α-葡萄糖苷酶活性进而阻止碳水化合物的消化吸收和糖类的生成.工业上,α-葡萄糖苷酶常用来将淀粉转换成发酵糖,这是酒精生产的重要步骤.这种酶还可以水解各种各样的吡喃葡萄糖苷,例如蔗糖,海藻糖和麦芽糖.然而,对这种酶折叠过程中的构象和活性变化研究不多.因此,对该酶结构和功能的研究具有重要意义. 三氟乙醇(简称TFE)的变性实验有助于理解酶的催化作用,稳定性,包括维持酶二级和三级结构的作用力,构象的柔性,紧密性和折叠途径.因此TFE常被用做研究酶结构特征的变性剂,而且TFE对酶活性和蛋白质稳定性的影响已经得到了很好的证明.已经做了对酶活性和结构在有机溶剂中的变化的广泛的研究.TFE在蛋白质折叠研究中常被用来做潜溶剂,因为它能够在浓度较低的时侯通过破坏疏水结构从而使蛋白质的三级和四级结构不稳定,TFE也常被用来鉴定与蛋白质聚集相关的疾病. Zn2+是很多酶的辅助因子,也充当转录因子角色和突触传递中的底物.Zn2+是有助于机体正常生长和发育,增强免疫功能,促进伤口愈合.因此Zn2+是机体的一个必要成分,在新陈代谢和疾病中起着重要的作用.由于Zn+在细胞功能方面的重要性,维持身体健康要求饮食中含有足够多的Zn2+.但是,有研究表明在特定条件下Zn2+会直接抑制酶的功能,α-葡萄糖苷酶和Zn+的关系还不是很清楚,先前基于精浆内含物的研究显示a-葡萄糖苷酶和Zn2+可能在人类生殖方面起重要作用,但是α-葡萄糖苷酶和Zn2+的直接关系还没有发现. 在TFE和Zn2+存在的情况下进行了对α-葡萄糖苷酶的动力学分析使我们更进一步了解其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用.通过用TFE和Zn2+结合计算机模拟进行了α-葡萄糖苷酶动力学研究,来观察任何诱导α-葡萄糖苷酶结构的改变.TFE和Zn2+诱导α-葡萄糖苷酶的失活研究为这种酶的抑制作用提供了新的认知,同时暗示了TFE和Zn2+可能具有的临床应用. 研究方法 1)测量不同浓度TFE对α-葡萄糖苷酶的活性影响并记录数值. 2)保持底物浓度不变,改变TFE和α-葡萄糖苷酶的浓度,同样测定其活性,并作图对比判断抑制类型. 3)改变TFE和底物的浓度,保持酶的浓度不变,测定数据作双倒数图,判断抑制动力学参数. 4)使用不同高浓度的TFE,固定底物浓度和酶浓度,按照作用时间不同测定活性,绘制酶活性的抑制变化时间过程图. 5)通过内源荧光和ANS结合荧光光谱学分析方法分析其三级结构特征. 6)最后使用计算机模拟同源建模的方式,预测α-葡萄糖苷酶3D结构及其与TFE的结合位点. 7)测定不同浓度Zn2+对α-葡萄糖苷酶的活性影响,并记录数值. 8)保持底物浓度不变的情况下,改变Zn2+和a-葡萄糖苷酶的浓度,同样测定其活性,并作图对比判断抑制类型. 9)使用不同浓度的Zn2+,固定底物浓度和酶浓度,按照作用时间不同测定活性,绘制酶活性的抑制变化时间过程图. 10)改变Zn2+和底物的浓度,保持酶的浓度不变,测定数据作双倒数图,判断抑制动力学参数. 11)最后使用计算机模拟的方式,预测α-葡萄糖苷酶与Zn2+的结合位点.结果 1)TFE对α-葡萄糖苷酶的结构和功能影响研究 TFE浓度低的时候(低于2%)α-葡萄糖苷酶活性有轻微的激活,之后随着TFE浓度的增加其活性丧失呈现剂量依赖性.半抑制剂浓度IC50大约是7±0.2%(0.97±0.028M).TFE浓度低于2%时酶活性与天然酶活性相比增加20%.当TFE浓度增加到12%时,酶的活性完全丧失.使酶活性完全丧失需要相当高的浓度,这很可能跟TFE的温和亲电子性有关.我们通过不同浓度的酶和不同浓度的TFE做剩余活性曲线判断TFE对酶作用的可逆性.结果中可以看出,所有的直线都经过原点,表明TFE对酶的作用是可逆的. 通过时间间隔实验测量出速率常数并估算失活动力学常数.TFE对葡萄糖苷酶活性的减少属于时间依赖性的一级反应.当TFE浓度低于2%时,酶的活性不但不会丧失反而会激活了20%.当TFE活性高于6%时,活性以两种途径丧失:一部分在非常短的时间内丧失(不超过30秒)以至于我们不能够测量出来,余下部分以一级动力学反应过程逐渐失活. 通过内源荧光光谱测量TFE对α[-葡萄糖苷酶结构的影响.我们观察到了TFE与a-葡萄糖苷酶的结合直接诱导a-葡萄糖苷酶构象变化:TFE浓度低于2%时,荧光光谱没有变化,但是当浓度超过3%时,荧光光谱发生了显著的改变,TFE浓度为50%时,最大峰位置的红移达到最高值,这表明TFE和α-葡萄糖苷酶的结合达到饱和状态.我们用ANS结合荧光来观察TFE诱导α-葡萄糖苷酶疏水性表面的变化.结果显示,随着荧光强度的增加,TFE诱导α-葡萄糖苷酶的疏水表面逐渐暴露出来.综上所述,内源和ANS-荧光探针都直接反映出TFE诱导a-葡萄糖苷酶发生了去折叠现象. 利用HHsearch和T-Coffee方法从十个模板结构中找出序列对比.我们用PQR-SA开发出了α-葡萄糖苷酶的同源结构.TFE对α-葡萄糖苷酶诱导失活的模拟对接显示:ASP68,TYR71,VAL108,HIS111,PHE177,ASP214,THR215,GLU276,HIS348,ASP349和ARG439等氨基酸残基与TEE发生了相互作用,分子动力学模拟证实了TFE诱导α-葡萄糖苷酶失活时的结合机制和结合位点.我们通过10毫秒分子动力学模拟,模拟结果显示TFE贯穿到了酶的核心,停留在与葡萄糖基团结合的氨基酸残基上,这表明TFE可能是一种抑制剂,能抑制α-葡萄糖苷酶的活性. 2)Zn2+对α-葡萄糖苷酶的结构和功能影响研究 在Zn2+浓度为0.3mM时,酶的活性完全丧失,半抑制剂浓度IC50大约是0.056±0.006mM,a-葡萄糖苷酶活性的丧失需要相当高浓度Zn2+.Zn2+对α-葡萄糖苷酶活性抑制的可逆性结果显示所有直线都通过原点,表明Zn2+抑制酶的活性反应是是可逆的.二次作图可以看出Zn2+对α-葡萄糖苷酶的抑制机制并不是简单的直线混合型抑制而是抛物线混合型抑制.利用半对数图标绘的动力学分析显示单相和双相失活包含快相和慢相两个过程,随着Zn2+浓度的增加单相发展成两相进程,所有进程都是一级动力学. 观测到Zn2+结合α-葡萄糖苷酶直接诱导三级结构改变.随着剂量的加大,荧光光谱强度明显减少,最大峰值发生明显的红移.当Zn2+浓度为50mM时,离子浓度趋于饱和状态红移达到最大峰值.通过ANS结合荧光光谱的测量发现由于Zn2+的结合,使α-葡萄糖苷酶的疏水表面得到轻微的暴露. 同时对Zn2+和α-葡萄糖苷酶进行了10毫微秒的分子动力学模拟.模拟显示10个锌离子可能和57个α-葡萄糖苷酶残基发生相互作用.分子动力学模拟也证明了Zn2+对α-葡萄糖苷酶的结合机制,显示Zn2+结合位点并不是落在α-葡萄糖苷酶的葡糖糖结合口袋. 结论 1)TFE和Zn2+可以导致α-葡萄糖苷酶的变性. 2)TFE和Zn2+诱导的α-葡萄糖苷酶结构变化中,活性位点的稳定性比其他部分结构的稳定性更高. 3)低浓度TFE和Zn2+诱导了整体结构的变化,但活性位点仍然保持完整. 4)TFE和Zn2+不直接与底物竞争,但会改变α-葡萄糖苷酶三级结构. 5)TFE和Zn2+与α-葡萄糖苷酶配体结合导致了酶活性的混合型抑制. 6)α-葡萄糖苷酶三级结构改变的原因是疏水表面的暴露. 7)计算机模拟TFE和Zn2+与α-葡萄糖苷酶结合中,三氟乙醇结合位点位于活性位点口袋中,而Zn2+结合位点不位于活性位点口袋中. 本研究为进一步研究α-葡萄糖苷酶抑制剂提出了新的对策,为计算机模拟抑制剂与酶结合提供了方法.

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关键词：

葡萄糖苷酶 三氟乙醇 酶动力学 计算机模拟 糖尿病 转录因子

学位级别：

硕士

学位年度：

2013

DOI：

10.7666/d.Y2406367

被引量：

9