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打破KRAS靶点“不可成药”的王牌药物「AMG 510」之诞生历程
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2021年5月29日，美国FDA宣布加速批准安进公司（Amgen）开发的Lumakras（sotorasib，AMG510）上市，用于治疗携带 KRAS G12C 突变的非小细胞肺癌患者,这些患者的肿瘤具有称为 KRAS G12C 的特定基因突变类型，KRAS 突变约占非小细胞肺癌突变的 25%，KRAS G12C 突变约占非小细胞肺癌突变的 13%。 RAS基因中的突变是人类癌症中最常见的激活突变，其发生约在30%的人类肿瘤中，RAS基因家族包含 Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因( Kirsten rat sarcoma viral oncogene,KRAS)， Harvey鼠肉瘤病毒癌基因( Harvey rat sarcoma viral oncogene,HRAS)和神经母细胞瘤病毒致癌基因( Neuroblasto- ma rat sarcoma viral oncogene,NRAS)3种亚型。  人类RAS蛋白异构体（来源：文献1）RAS基因驱动的癌症中有85%是由KRAS的突变引起的，90%的胰腺癌，30~40%的结肠癌，15-20%的肺癌中都存在KRAS基因突变。在KRAS突变的肿瘤中，80%的致癌突变发生在12号密码子中，最常见的突变位点有 KRAS G12D、 KRAS G12V和 KRAS G12C。KRAS蛋白是一种小GTP酶( small Gtpase)，是参与肿瘤细胞生长和生存的细胞内信号通路的重要介质“。在细胞内，KRAS蛋白在失活和激活状态之间转变，当KRAS与鸟苷二磷酸（GDP）结合时，它处于失活状态，当它与鸟苷三磷酸（GTP）结合时，它处于激活状态，并且可以激活下游信号通路。KRAS在失活与激活状态之间的转换受到两类因子的调节。一类是鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），这类蛋白催化KRAS与GTP的结合，从而促进KRAS的激活，其中包括SOS蛋白；另一类是GTP酶激活蛋白（p120GAP），这类蛋白能够促进与KRAS结合的GTP水解成为GDP，从而抑制KRAS的活性。  RAS GDP-GTP 循环（来源：文献1）
在体细胞中KRAS的激活突变是癌症的重要标志。然而，尽管KRAS是最早发现的致癌基因之一，但30年的努力未能发现KRAS蛋白临床上有价值的抑制剂。KRAS的以下2个特征导致其作为药物靶标的研发中存在诸多挑战：KRAS以皮摩尔浓度的亲和力与GDP和GTP结合，严重阻碍了开发核苷酸竞争性抑制剂； KRAS蛋白缺少理想的小分子结合口袋，难以设计高亲和力变构抑制剂。 2013年，Shokat和同事报道了一种旨在克服这些挑战的新策略，利用半胱氨酸硫醇独特的亲核性，使用共价抑制剂靶向KRAS G12C的12活性半胱氨酸。他们基于KRAS G12C在GTP结合态下的结构建立了二硫键片段筛选模型，鉴定出与switch II 口袋结合的2E07(18)和6H05(19)。  Tethering化合物选择性地与致癌的K-Ras(G12C)结合（来源：文献2）小分子化合物与这个“口袋”结合后能够将KRAS G12C突变体锁定在失活的构象状态下，从而为抑制KRAS突变体的活性提供了潜在的靶标，这一发现为进一步的研究奠定了基础。2016年，Matthew P等描述了ARS-853，一种KRAS G12C的选择性共价抑制剂，通过与GDP结合的癌蛋白结合并阻止激活，抑制突变KRAS驱动的信号传导。  ARS-853结构式 （来源：文献4）研究同时发现，KRAS G12C突变体并非永久处于与GTP结合的激活状态，是在与GTP结合的激活状态和与GDP结合的失活状态之间快速转换，突变体KRAS处于激活状态几率更大。设计一种共价抑制剂，能够选择在KRAS突变体转换为失活状态时与其结合，进而将KRAS突变体失活，那么这种抑制剂就是比较理想的。2018年，Janes等对ARS-853结构进行改进后，合成了一系列喹唑啉类化合物，其中代表性药物是ARS-1620，ARS-1620对KRAS G12C的作用速率比ARS-853的速率高10倍。在H358细胞系中，ARS-1620抑制RASGTP结合，并选择性地抑制MEK、ERK、RSK、S6和AKT的磷酸化，但对阴性对照组（A549, H460, and H44 cells）无影响，说明它选择性地抑制G12C突变细胞，而不是G12C野生型细胞。  ARS-1620的基本特征（来源：文献5）由于switch II口袋的小尺寸，额外的蛋白配体相互作用受到限制;这种限制使ARS-1620的进一步改进变得困难。然而，随着ARS-1620和组氨酸His95之间明显氢键的发现，研究人员之后又取得了新的进展，His95的选择性取向形成的表面凹槽可以被芳香环占据，这一发现可能会增强药物与KRAS G12C之间的相互作用。2019年，安进公司科学家首次在Nature杂志上报道第一个在临床开发的KRAS(G12C)抑制剂AMG 510。在临床前研究分析中，AMG 510治疗导致KRASG12C肿瘤的消退，并提高化疗和靶向药物的抗肿瘤疗效，在免疫小鼠中，AMG 510治疗导致了促炎的肿瘤微环境，并单独以及与免疫检查点抑制剂联合产生了持久的治疗。  （来源：文献6，已修改）
治愈的小鼠抑制了同基因的KRASG12D肿瘤的生长，这表明对共享抗原的适应性免疫，此外，在临床试验中，AMG 510在第一个给药队列中显示了抗肿瘤活性，对缺乏有效治疗的患者来说，这是一种潜在的变革性治疗。2020年，JMC杂志进一步报道了安进科学家为发现AMG 510所作出的大量基础性工作。
利用先进的发现筛选平台，安进公司研究人员鉴定了一系列KRAS G12C的选择性共价抑制剂，这些抑制剂经过了优化(通过基于结构的设计和额外的靶向文库合成)，最终优选出了先导化合物1，化合物1可以在生化和细胞检测中有效灭活KRAS G12C。化合物1与GDP-KRAS G12C共晶揭示化合物 1 采用新颖的结合模式，相对于ARS - 1620的四氢异喹啉环1占据一个以前未被利用的神秘口袋，此口袋由由H95, Y96和Q99组成。  ARS-1620、化合物1与GDP-KRAS G12C结合模式比较（来源：文献8）虽然与ARS-1620相比，该隐秘的口袋参与导致了细胞效能的多重增强，但化合物1在啮齿动物模型系统中清除率非常高，口服生物利用度很低，因此不适合在体内使用。
因此，需要基于化合物1和ARS-1620，进一步优化改造发现针对H95/Y96/Q99 口袋更理想的抑制剂。化合物1和ARS-1620结合模式的叠加表明，取代ARS-1620的喹唑啉氮(N1)可能提供了进入H95隐袋的另一种途径，从而产生新的KRAS G12C的增强效价抑制剂。  GDP-KRAS G12C结合构象的叠加：ARS-1620(蓝色)和化合物1(粉色)
（来源：文献8）为了验证这一假设，制备了一系列邻苯二嗪类似物，其中邻苯二嗪核(X = N, Y = C)的C4位置(Y)被一系列芳基取代基取代。  （来源：文献8）化合物2与GDP-KRAS G12C共结晶，证实了化合物2与ARS-1620的结合模式相似，只是新引入的C4苯基取代基占据了H95/Y96/Q99的隐秘口袋。在2的苯环上加入了一系列越来越大的邻位取代基，目的是加强与Y96的接触，令人鼓舞的是，甲基、乙基取代均导致效力增加。异丙基取代被证明是最优的，然而，其生化和细胞IC50值与ARS-1620相当。上述系列中化合物9体外实验中表现出较强的活性，以（R）-9为基础，对哌嗪取代基(R2)和亲脂端基(R1)区域进行优化。  （来源：文献8）上述系列化合物中化合物18表现出较好的生物利用度和细胞活性，化合物18自然成为下一步优化的基础。令人失望的是，研究人员很快发现了化合物18的一个新的挑战，源于关键部位的轴向手性。R-和S-构型在25℃时发生了缓慢的相互转化，半衰期为8天，如此行为可能会使(R)-18作为纯物质的发展变得非常复杂。  化合物18阻转异构体在25°C时构型不稳定（来源：文献8）使用两种方法来评估阻转异构体相互转换自由能垒，另外从合成角度进一步对18进行结构修饰，合成系列化合物，进行生物学和代谢动力学评价。  （来源：文献8）上述系列化合物优选出化合物 （R）-24进一步进行研究。  （来源：文献8）(R)-38表现出了优异的生物活性和代谢性能，（R)-38在大鼠和犬体内的药代动力学参数与在小鼠体内的药代动力学参数一致，所有物种的口服生物利用度均合理。尽管在所有物种中，(R)-38的终末半衰期都相对较短，但这并不被视为一种不利因素，因为我们从先前的药理学研究中发现，KRASG12C可以在没有持续药物暴露的情况下实现持久的共价。这种持续的PD效应与共价抑制剂的预期一致，即目标抑制的持续时间不是由目标IC50覆盖的持续时间决定的，而是由共价失活的目标蛋白的再合成率决定的。基于(R)-38引人入胜的药理特征及其在体内对KRAS p.G12C突变肿瘤的显著退变能力，其有前途的生物制药特性，以及其在临床前毒理学模型中的出色耐受性，安进科学家提名(R)-38临床开发为AMG 510。  （来源：文献8）
AMG 510于2018年8月进入人体临床试验，评估其安全性、耐受性、药代动力学特性和KRAS p.G12C突变肿瘤的疗效(NCT0360088334)。2021年5月29日，美国FDA宣布加速批准安进公司（Amgen）开发的Lumakras（sotorasib，AMG510）上市，用于治疗携带 KRAS G12C 突变的非小细胞肺癌患者。此为全球首个靶向KRAS的药物，意义重大。参考： 1.Hobbs G A, Der C J, Rossman K L. RAS isoforms and mutations in cancer at a glance[J]. Journal of cell science, 2016, 129(7): 1287-1292. 2.Ostrem J M, Peters U, Sos M L, et al. K-Ras (G12C) inhibitors allosterically control GTP affinity and effector interactions[J]. Nature, 2013, 503(7477): 548-551. 3.Yang A I, Li M, Fang M. The Research Progress of Direct KRAS G12C Mutation Inhibitors[J]. Pathology and Oncology Research, 2021, 27: 67. 4.Patricelli M P, Janes M R, Li L S, et al. Selective inhibition of oncogenic KRAS output with small molecules targeting the inactive state[J]. Cancer discovery, 2016, 6(3): 316-329. 5.Janes M R, Zhang J, Li L S, et al. Targeting KRAS mutant cancers with a covalent G12C-specific inhibitor[J]. Cell, 2018, 172(3): 578-589. e17. 6.Canon J, Rex K, Saiki A Y, et al. The clinical KRAS (G12C) inhibitor AMG 510 drives anti-tumour immunity[J]. Nature, 2019, 575(7781): 217-223. 7.Gentile D R, Rathinaswamy M K, Jenkins M L, et al. Ras binder induces a modified switch-II pocket in GTP and GDP states[J]. Cell chemical biology, 2017, 24(12): 1455-1466. e14. 8.Lanman B A, Allen J R, Allen J G, et al. Discovery of a covalent inhibitor of KRASG12C (AMG 510) for the treatment of solid tumors[J]. 2019. |
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