中科院1区7分+: 清华李梢团队以网药揭示中成药摩罗丹治疗慢性萎缩性胃炎的机制

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背景：摩罗丹（MLD）是一种治疗慢性萎缩性胃炎（CAG）的中成药。然而，MLD 治疗 CAG 的作用机制 (MoA) 仍不清楚。目的：基于网络药理学阐明MLD治疗CAG的作用机制。研究设计：基于网络药理学整合计算预测和实验验证。

方法：通过LC-MS/MS对MLD化合物进行计算扫描，并基于网络目标预测方法识别化合物的目标谱。通过目标谱的层次聚类，将 MLD 中的化合物与用于治疗胃炎的西药进行比较。分析了MLD的关键生物功能模块，构建了草药-生物功能模块网络，以阐明MLD草药用于CAG的组合规则。实验上，在1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）诱导的GES-1细胞中，从表型水平和分子水平验证了MLD对不同生物功能模块的影响。

结果：计算结果表明MLD中化合物的目标谱可以覆盖文献报道的大部分生物分子。MLD的MoA可以涵盖大多数CAG西药的MoA类型。MLD治疗CAG涉及多种生物功能模块的调节，例如炎症/免疫、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、消化和代谢。实验结果表明，MLD能够抑制MNNG诱导的GES-1细胞增殖，促进细胞凋亡和分化，降低炎症水平，促进脂滴积累。

结论：结合计算预测和实验验证的网络药理学框架为探索MLD的MoA提供了新的途径。

介绍

慢性萎缩性胃炎（CAG）是最常见的消化系统疾病之一，以粘膜萎缩、血管裸露和粘膜结节为特征。CAG与肠上皮化生和不典型增生一起，也是从炎症到肠型胃癌（GC）发病机制中的主要癌前病变之一。诊断患有 CAG 的患者通常会出现上腹疼痛、消化不良、腹胀、恶心、呕吐、嗳气、食欲不振和体重减轻。最重要的是，患有 CAG 的患者患 GC 的风险增加，估计每年 GC 的风险为 0.1%/年。尽管如此，一些病理学家声称 CAG 是一个可逆过程，并且在根除幽门螺杆菌 (HP) 后可能会出现改善。

摩罗丹 (MLD) 已在临床上用于治疗 CAG 数十年。MLD含有18种草药，即白芍、白术、百合、川芎、当归、地榆、茯苓、鸡内金、九节菖蒲、麦冬、蒲黄、三七、石斛、乌药、玄参、延胡索、茵陈、泽泻。临床研究表明，MLD 可以改善 CAG 的组织学、内镜检查结果和症状。研究表明MLD联合雷贝拉唑三联疗法治疗HP相关慢性胃炎效果更佳，可显着改善临床症状。杜等人。（2015）研究表明，与叶酸联合维生素E相比，MLD能有效改善胃粘膜萎缩和肠化生，特别是逆转低度上皮内瘤变。实验研究表明MLD在治疗CAG方面具有多种药理作用，包括抑制炎症、平衡免疫、调节胃肠动力、调节胃液分泌并改善胃癌前病变。然而，MLD治疗CAG的机制仍不清楚。

网络药理学是理解多组分药物的一种有前途的方法提出了一个新概念“网络靶点”，它将单个分子上的药物靶点概念扩展到其对生物网络的系统作用，以解决草药配方等多种化合物系统的问题。“网络靶标”作为中药网络药理学的核心概念，为分析中药复方的生物学基础、指导中药有效成分的发现提供了潜在的研究策略。中医网络药理学的理论和方法已成功应用于分析中药配方，如葛根芩连汤、六味地黄丸、清络饮、血必净和柴胡疏肝散。中医网络药理学理论一直在不断发展，在中医方剂智能推荐、胃癌极早期细胞的发现等诸多领域取得了巨大成就。

为了解决 CAG 治疗中 MLD 的系统性MoA，我们通过整合网络药理学评估和实验验证来实施系统策略。对MLD中化合物的靶点进行了预测，预测结果的准确性非常高。将MLD的化合物与用于治疗胃炎的西药进行比较，结果表明MLD可能具有与西药相似的效果。构建MLD的草药-生物学功能网络来解释MLD治疗CAG的调节作用。实验验证表明，MLD能够抑制1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG）诱导的GES-1细胞增殖，促进细胞凋亡和分化，降低炎症水平，促进脂滴积累。这项研究提供了一种有前途的方法来解释 MLD 等草药配方发挥治疗作用的 MoA，并提供了一个连接计算预测和实验验证的系统框架。本研究的流程如图1所示。

材料和方法

MLD化合物的鉴定及治疗胃炎西药的收集

采用LC-MS/MS对样品MLD的化学成分进行定量，结果见表1（文末）。首先，仔细称取98个标准品，用甲醇将每个标准品的一级标准储备液配制成10 mg/ml。然后，仔细配制98个标准品的储备液，然后用20%甲醇稀释成系列最终混合标准工作液：1000、500、200、100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2和0.1纳克/毫升。将MLD研磨，准确称取MLD样品3份，每份50mg，进行检测。将研磨好的样品转移至2ml离心管中，加入1ml 80%甲醇，涡旋混合2分钟，超声处理20分钟，再次涡旋混合2分钟，最后在13,000rpm、4℃下离心10分钟。使用20%甲醇将上清液稀释10倍或100倍用于进一步LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析在清华大学医药技术中心AB SCIEX QTRAP 5500三重四极杆质谱仪上进行，具有正、负ESI电离模式和MRM扫描模式。LC 分离通过 XSelect HSS T3 分析柱（2.1 × 100 mm，2.5 μm，Waters）完成，Exion LC AD 系统（AB Sciex）配备二元梯度泵。分别使用乙腈和0.05%甲酸水溶液作为溶剂A和B，流速为0.2ml/min。梯度曲线从 0% 溶剂 A 开始，然后在 17 分钟内线性增加至 100% 溶剂 A 并保持 2 分钟，最后在 2 分钟内线性下降至 0% 溶剂 A。柱温设置为 35 ℃，样品室温度设定为10℃，进样量为5μl。MS参数设置如下：ESI离子源温度设置为500℃；气帘气体设定为 30 psi；碰撞激活解离 (CAD) 气体设置：中，对于正电离模式和负电离模式，离子喷雾电压分别设置为5500V和4500V。离子气体 1 和 2 的参数设置为 50 psi。数据采集是通过AB SCIEX Analyst 1.7.1软件进行的，而数据分析是通过SCIEX OS-MQ 1.6.1软件进行的。

使用我们自己建立的数据库 HerbBioMap (Zhou et al., 2003) 将 MLD 的化合物映射到每种草药 (表 S1)。适用于胃炎的西药均来自 DrugBank (Wishart et al., 2017) 数据库。所选西药涵盖治疗胃炎的常用西药种类，包括H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、胃泌素抑制剂、胃动力药物、抗胆碱能药物、胃粘膜保护剂和根除HP的抗生素。西药详细信息见表S2。

蛋白质-蛋白质相互作用数据

在这项工作中，蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据被用来构建分子网络。PPI 数据来自多个公共 PPI 数据库 HPRD（第 9 版）（Keshava Prasad 等人，2009）、BioGRID（2019 更新）（Rose等人，2018）、IntAct（Samuel 等人，2011）、MINT（ 2012 年更新 Homo sapiens) (Luana et al., 2012)和 STRING (V10.5) (Damian et al., 2016)。去除重复的基因后，最终关注了18,127个基因和523,380个相互作用。

MLD 中化合物的目标预测

MLD 中每种化合物的靶标分布均由我们之前建立的高性能 DrugCIPHER-CS 预测（Zhao 和 Li，2010）。DrugCIPHER-CS是一种全基因组药物靶点预测方法，它使用回归模型建立MLD中的化合物与蛋白质之间的关系。具体来说，DrugCIPHER-CS计算MLD的化合物-种子药物的化学相似性向量和药物-蛋白质的接近向量之间的相关性得分，并估计化合物-蛋白质相互作用的可能性作为最终的计算结果。药物 d 和蛋白质 p 之间的紧密度可以公式化如下：

药物 d 和蛋白质p 之间的可能性定义为一致性分数：

预测目标的文献挖掘验证

由于这里对各化合物的靶点进行了计算预测，因此需要验证预测结果的可靠性。我们通过文献挖掘验证了预测目标。对于MLD中的每个化合物，我们首先从国际公共数据库PubMed和中国数据库CNKI中按摘要名称检索已报道的生物实体，例如基因、RNA或蛋白质，并统计检索到的论文总数。其次，下载所有检索到的摘要，并对摘要中提到的生物实体进行扫描和提取。为了得到统一的结果，根据生物实体的名称将英文挖掘结果（PubMed）和中文挖掘结果（CNKI）进行合并。最后，每种化合物的预测目标可以直接或间接连接到挖掘的生物实体（PPI或信号通路），因此可以通过以下方式计算精度：

化合物的层次聚类

我们通过层次聚类将MLD 中的化合物与用于治疗胃炎的西药进行比较。对于每种化合物，所有 1950 个可药物靶标的分数均从 DrugCIPHER-CS 获得并用于聚类。西药的成药靶点也按同样的方法计算。K 均值聚类用于通过平方和 (WSS) 内的总数来评估聚类数量。当簇数设置为6时，WSS大幅下降，且变化相对平稳。因此，根据评价结果最终确定了6个簇。然后使用欧氏距离进行无监督层次聚类。

生物功能模块网络的建立

为了研究MLD中草药的生物学功能，我们首先建立了生物学功能模块网络。根据关键词映射和语义描述，对所有KEGG信号通路/GO生物过程进行分类。在语义描述上，对每个KEGG信号通路/GO生物过程术语进行人工阅读和理解，然后将其分类为不同的生物功能模块，例如炎症/免疫、细胞增殖、细胞凋亡等。在关键词映射方面，我们从国际公共数据库中收集了胃炎到GC的临床数据，得到了细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡等从炎症到癌症发病的关键生物学过程组成的功能网络（郭等人，2017b)。

MLD靶点计算及MLD中药材功能富集分析

并获得 MLD 的目标。为了深入了解每种草药的详细功能，我们首先以与MLD相同的方式获得每种草药的目标（Liang et al., 2014）。然后，我们使用注释、可视化和综合发现数据库 (DAVID) 检查了每种草药靶标显着丰富的生物过程（Dennis 等，2003）。主要检查各药材的靶点富集KEGG信号通路/GO生物过程。在这里，我们保留了所有富集的 KEGG 信号通路/GO 生物过程（p值 < 0.001）。每种草药富集的KEGG信号通路/GO生物学过程列于表S3中。

草药-生物功能模块网络的构建

还对MLD靶点进行了富集的KEGG信号通路/GO生物学过程，MLD靶点主要分布在细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、免疫/炎症、代谢和消化生物功能模块（表2见文末）。草药-生物功能模块网络给出了MLD中草药与6个关键生物功能之间的关系模块。该网络还包括基因（表 S4）。基因的选择规则是：（1）基因的表达能够表征生物功能模块的变化。 (2)与CAG或MLD发病机制相关的基因的作用。如果该模块的 KEGG 信号通路/GO 生物过程显着富集（p 值 < 0.001）计数在所有模块中排名前 3 或 KEGG 信号通路/GO 显着富集计数，则一组草药组连接到一个生物功能模块该模块的生物过程不少于5个。一个生物功能模块与其他生物功能模块相连，如果它们相关的KEGG信号通路/GO生物过程中具有相同的基因。如果一个基因在 PPI 网络中连接，则它们与其他基因相连。

试剂和细胞培养

塞来昔布（纯度：99.3%）购自solarbio（中国北京）。加入 10 ml 的 MLD，配制 0.25 g MLD/ml 溶液。dd H2O 加入 2.5 g MLD（中国河北邯郸制药有限公司）粉末，37℃水浴 30 min，超声处理 1 h，7000 g 离心 2 min，上清液滤过0.22 μM 过滤器。

将细胞在塑料瓶或多孔板中于 37°C、5% CO2 的湿润气氛中培养，使用含有 10% 胎牛血清、50 U/ml 青霉素和 50 mg/ml 链霉素的 RPMI-1640 培养基。指数生长的细胞用于实验。对于定量增殖测定，将 6 × 10[3] 个细胞接种到含有常规生长培养基的96 孔板中。孵育24小时后，将细胞在含有溶解在dd H2O中的2500μg/ml MLD或溶解在二甲基亚砜（DMSO）中的100μM塞来昔布的培养基中孵育。在含有0.1％DMSO的培养基中培养的对照细胞，证实对细胞生长没有影响。

细胞增殖测定

将细胞接种于96孔微孔板（6000个细胞/孔，100μl）中，并在加湿培养箱中常规培养24小时。预培养 24 小时后吸出培养基，更换为含有塞来考昔 (100 μM) 和/或 MLD (2500 μg/ml) 的培养基。孵育 48 小时后，通过Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 测量细胞活力（日本九州同仁岛）根据制造商的说明。ELISA：测定细胞上清液中的TNF-α和IL-6活性12孔细胞用20 μM MNNG刺激8 h建立炎症模型(Tong et al., 2021)，加药24 h收集上清液。使用KeyGen BioTECH（中国江苏）的ELISA试剂盒根据制造商的说明测定细胞上清液中TNF-α和IL-6的活性。

TdT 介导的 dUTP 末端标记 (TUNEL) 染色

将细胞置于玻璃盖玻片上，固定在 4% 多聚甲醛中（室温 20 分钟），然后用 0.1% Triton X-100 透化（室温 30 分钟）。然后，使用一步TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（KeyGen BioTECH，江苏，中国）根据制造商的说明评估细胞凋亡率。使用荧光显微镜观察细胞凋亡情况。

碱性磷酸酶 (ALP) 活性的测量

将细胞以 1 × 10[5] 个细胞/ml 的密度接种在 12 孔微孔板中，并用塞来昔布 (100 μM) 和/或 MLD (2500 μg/ml) 处理 48 小时，然后进行 ALP 活性测定。然后用非变性组织/细胞裂解液（Solarbio，北京，中国）溶解细胞。最后，使用 QuantiFluoTM 碱性磷酸酶测定试剂盒（BioAssay Systems，加利福尼亚州，美国）在 360/450 nm 处通过荧光测定 ALP 活性来测量 ALP 活性。在此分析中进行了两个独立的实验。

BODIPY 493/503 染色

每组细胞（4.8 × 10[4] 细胞/孔，1 ml）接种于含 RPMI 1640 加 10% FBS 的 12 孔板中。接种后 124 小时的细胞血清饥饿 1 小时，用 BODIPY® 493/ 503（Invitrogen，加利福尼亚州，美国）和 DAPI（KeyGen BioTECH，江苏，中国）染色 25 分钟，并使用荧光显微镜成像。

蛋白质印迹法

使用RIPA缓冲液（Solarbio，北京，中国）提取细胞中的总蛋白，并使用BCA蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国）检测浓度。简而言之，将上清液(40 μl) 与 5 × SDS-PAGE 上样缓冲液(10 μl) 混合，并在 98 °C 下变性 5 分钟。用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离不同样品中的蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯微孔膜上。跨膜后，用溶解在TBST中的5%脱脂牛奶封闭膜2小时，然后与一抗在4℃下孵育12小时。用TBST洗涤后，将膜与二抗在室温下孵育2小时，并通过奥德赛红外成像系统（Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE，USA）进行测定。

统计分析

所有单因素方差分析（ANOVA）的实验统计计算均使用GraphPad Prism 8.0软件进行。实验结果以平均值±标准差表示，p值 /阅读下一篇/ 返回网易首页 下载网易新闻客户端