单细胞凝胶电泳的操作流程与注意事项

一、分离制备单细胞悬液：

1. 体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。

2. 体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。

二、胶板制备：

1. 取100 μl于45 ℃水浴中保温的0.5%NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。盖玻片推匀，不能有气泡，4度凝固5至8分钟。

2. 水平取下盖片，取100 μl于37 ℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液(约400个细胞)混匀，立即铺片，加上盖玻片，4度凝固5至8分钟。

三、细胞裂解与电泳：

1. 将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4 ℃预冷的细胞裂解液中，在4 ℃下裂解2.5到3小时。

2. 取出胶板，用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中，浸泡在4 ℃预冷的电泳液中解旋20分钟。

3. 玻片水平放置阳极端附近，4 ℃电泳20到25分钟(25 V，300 mA)。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。

四、中和与染色：

1. 电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次10分钟，共中和3次，每次要更换中和液。最后晾干。

2. 取出胶板，置于染色缸中，在2 μg/ml的EB染色液中，暗处染色5到10分钟。

3. 蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。

稍晾干，滤纸吸去多余水分，尽快在荧光显微镜下观察。

注意事项：

1. 细胞一定要消化成单个的，如果你养的细胞是悬浮生长的，或者形状是圆形的(例如hela)，那么你可以直接用细胞刮收细胞做，否则，如果细胞是非圆形的，例如成纤维细胞等，一定要用胰酶消化，使之成圆形，然后才可做实验。很多做彗星实验总是出不来结果的，可以考虑下是否是这方面的原因。

2. 电泳时，电流与电压强度在每次实验时要恒定(例如：20 V，200 mA恒定)，这样出来的慧尾才有分析价值，否则你不知道分析因素的差异是由电泳条件的改变引起的还是细胞处理不同引起的。

3. 关于掉胶的问题：盖玻片最好两面都涂上剥离硅烷(挺便宜的一大瓶，但是有毒)，这样会好很多

4. 裂解液是整个实验中最关键的因素，裂解液最终使用时必须是澄清没有任何沉渣的，如果没有溶解好是肯定影响实验的，如果常温不容易溶解的话可以放入4 ℃冰箱中一段时间，就比较容易溶解了

小结：本实验所有操作步骤从胶板制备开始到最后都应该在暗光或者红光下操作，实验的关键步骤是凝胶制备，一定要均匀平整无气泡，此外要避免试验中细胞裂解液等有毒物质对自己的伤害。