PCR的退火温度选择

熔解温度（

Tm

）是引物的一个重要参数。这是当

50

％的引物和互补序列表现为双链

DNA

分

子时的温度

.Tm

对于设定

PCR

退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证

引物同目的序列有效退火，

同时还要足够高，

以减少非特异性结合。

合理的退火温度从

55

℃

到

70℃。退火温度一般设定比引物的

 Tm

低

5℃。

设定

Tm

有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于

18

碱基的引物。

有的

是根据

GC

含量估算

Tm

。

确定引物

Tm

最可信的方法是近邻分析法。

这种方法从序列一级结构

和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

根据所使用的公式及引物序列的不同，

Tm

会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的

Tm

值，

所有退火温度只是一个起始点。

可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异

性。开始低于估算的

Tm5

℃，以

2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引

物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的

Tm

值。引物对的

Tm

差异如果超过

5℃，就会引物

在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物

Tm

不同，将退火温

度设定为比最低的

Tm

低5℃ 

或者为了提高特异性，可以在根据较高

Tm

设计的退火温度先进行

5

个循环，然后在根据较

低

Tm

设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部

分拷贝。

当引物长度低于

20

个

bp

可以根据

Tm=3GC+2AT,

对于更长的寡聚核苷酸，

Tm

计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) 

–

 600/size 

公式中，

Size = 

引物长度。