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转自:诺唯赞生物 RACE(rapid amplification of cDNA end)是研究新基因、解码未知序列的重要方式! 诺唯赞推出RACE技术全攻略专题干货,帮助大家吃透原理、玩转实验! 本期为RACE专题第二期——操作细节篇 RACE实验技术路线 如何设计特异性引物? 引物设计的特异性对于做RACE是至关重要的,5'/3' GSP(基因特异性引物)设计需要注意哪些点? ① 引物长度:23 - 28个核苷酸,建议不超过30个核苷酸; ② GC含量:50 % - 70 %; ③ Tm值:Tm ≥ 65℃,Tm > 70℃使用Touch Down PCR有助于提高产物特异性; ④ 较长(> 10 kb)或丰度较低的待测转录本:GSP引物设计尽量靠近cDNA的末端(≤ 3 kb); ⑤ 针对同一待测转录本可设计多条GSP,进行RACE扩增以提高成功率。 如何合成高质量cDNA? ① 体系配置好后,在72℃条件下孵育3 min后立即置于冰上,这是为了打开RNA的二级结构同时避免RACE中使用的引物较长出现相互交联的情况。 ② cDNA产物稀释:可根据目的转录本丰度高低及首次实验结果进行后续稀释倍数调整;在不清楚基因表达量高低或基因表达量很低时可以不稀释(可根据PCR或qPCR检测基因丰度)。 扩增程序怎么选? ① 需要根据GSP的Tm值选择PCR程序,若GSP引物的Tm值> 70℃,使用降落PCR(Touch Down PCR)有助于提高产物特异性。 ② 降落PCR:根据引物的Tm值设置一系列的退火温度,随着循环的进行,退火温度逐渐降低,使得特异目标产物进行优势扩增,兼顾目标产物的特异性和高产量。 巢式PCR怎么做? 掌握原理 巢式PCR通过两轮PCR反应,使用两对引物扩增特异性的DNA片段。第一对引物为GSP。第二对引物为NGSP(NGSP结合在上一轮PCR产物的内部,进行PCR扩增),使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。同时提高扩增倍数,降低了非特异性反应连续放大进行的可能性,并可以鉴定第一阶段反应是否正确。 明确适用情况 ① 上一轮PCR没有理想的特异产物(如无扩增产物、产物较弱、产物弥散),或者产物非特异条带过多、基因表达丰度低; ② 巢氏PCR与RACE结合可以提高克隆的准确度(RACE产物进行巢式PCR时,其固定接头巢式引物为Nested Primer); ③ 可设计多轮巢式引物进行巢式PCR扩增。 NGSP(巢式基因特异性引物)设计原则 ① 引物长度、GC含量、Tm值:同GSP(基因特异性引物)设计原则; ② 位置:NGSP须设计在GSP的3'端,建议NGSP的5'末端与GSP的3'末端有5 - 15 nt的重叠,有助于提高二轮巢式扩增时的特异性。 高回收率的产物纯化怎么做? 通过目的DNA片段切胶回收的方式进行产物纯化,推荐使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Vazyme #DC301)或其他等效产品。产物长度在200 bp - 3 kb之间,不建议目的片段长度 海量资讯、精准解读,尽在新浪财经APP |
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