浅谈特殊核苷酸的作用

前两期我们分享了寡核苷酸的荧光基团、淬灭基团修饰，以及间臂类修饰。本期推送将和大家分享寡核苷酸中特殊核苷酸的作用。在常见的A、T、G、C、U基础上，仅仅做了一点改变，或是某个原子的取代，或是某个基团的添加和缺失，但是却给寡核苷酸性质带来比较大的变化，赋予寡核苷酸新的功能。

应用：

2'-F是将核糖核苷酸的2'-羟基替换为氟原子。

1）ASO：ASO即anti-sense oligo nucleotide，是一种长度约在12~30nt的单链寡核苷酸片段，ASO的骨架和碱基上通常含有修饰以增强其功能。ASO主要是通过碱基互补配对与靶标mRNA结合，导致RNase H剪切靶标mRNA，从而抑制基因表达；也有ASO通过抑制ribosome翻译蛋白、调节RNA splicing等机制发挥作用。

向ASO中每掺入一个2'-F修饰的核苷酸，ASO与其靶标RNA结合的Tm值可升高约1.8℃，因此向ASO中引入2'-F可提高ASO与靶标的结合力，同时提高了ASO的核酸酶抗性。值得注意的是，我们提到ASO作用机制依赖于RNase H，而RNase H发挥作用需要RNA的2’-羟基，因此2’-羟基处的修饰可能影响ASO的功能，为解决这个矛盾，可采用Gapmer的设计方式：ASO两端的序列采用2’位修饰以提高核酸酶抗性和结合力，而中间未修饰部分可招募RNase H [1]。

图片来源：《Therapeutic Oligo nucleotides Targeting Liver Disease: TTR Amyloidosis》

2）aptamer（核酸适配体）：适当添加2'-F修饰的核苷酸可提高aptamer的血清稳定性，并可能提高aptamer与靶标的结合能力。例如Macugen（pegaptanib）是一个靶向VEGF的aptamer，被批准用于治疗眼部血管疾病，比如老年黄斑变性。该药物在血清中的半衰期长达18小时（未经修饰的aptamer在血清中的半衰期通常只有5分钟），并且研究发现2'-F修饰提高了aptamer与靶标配体的结合力[2]。

图片来源：《Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease》

(图a pegaptanib为红色碱基为2’-OMe修饰，蓝色碱基为2’-F修饰；图b为pegaptanib与VEGF结合)

3）siRNA：研究已经表明siRNA的sense-strand上引入2'-F修饰不影响RISC复合物的激活，因此2'-F可修饰在siRNA中，提高siRNA在血清中的稳定性[3]。

应用：

2'-OMe是将核糖核苷酸的2'-羟基替换为甲氧基。

1）2'-OMe修饰可以提高RNA的核酸酶抗性，经常被应用于ASO、aptamer、siRNA和sgRNA中。例如在sgRNA的5’端和3’端添加2'-OMe修饰与硫代修饰可以增加sgRNA的稳定性，从而提高其编辑效率[4]。

图片来源：《Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells》

（红旗处为修饰的碱基）

与DNA/RNA碱基互补配对相比，2'-OMe RNA/RNA的碱基互补配对更接近于RNA/RNA；因此在ASO中添加2'-OMe修饰可提高ASO对靶标RNA的结合力。

2）有研究发现，miRNA可以被与之互补的2'-OMe修饰的antisense oligo抑制[5]。

3）也有研究表明，将2'-OMe修饰选择性的添加到siRNA中，在不降低其基因沉默能力的同时，可以减少动物体内因注射siRNA导致的细胞因子的产生，即可以降低siRNA的免疫原性[6]。

应用：

2'-O-MOE与2'-OMe名字相近但实质不同，2'-O-MOE指的是在核糖核苷酸的2'-羟基上的氢替换为甲氧基乙基，这种修饰增加了寡核苷酸对于核酸酶的抗性。

2'-O-MOE修饰在ASO和aptamer中应用广泛。

例如Inotersen是一种序列5’和3’端修饰2'-O-MOE的ASO药物，其靶标是肝细胞transthyretin（转甲状腺素） mRNA的3'非翻译区，用于治疗遗传性转甲状腺素淀粉样病变（一种罕见的常染色体显性遗传病）。研究表明，2'-O-MOE修饰延长了药物的半衰期，提高了ASO药物与靶标mRNA的结合能力[7]。

图片来源：《Oligonucleotides to the (Gene) Rescue: FDA Approvals 2017–2019》

2'-O-MOE修饰在siRNA 5’端或3’端时可能会影响其RNA干扰效应，但是修饰在siRNA的中间位置则影响较小。

应用：

LNA称为锁核酸，是一个主体呋喃糖被“锁定”的双环结构。具体是通过2'-O和4'位之间添加亚甲基连接，赋予原本柔性的呋喃核糖刚性；并且LNA扭曲成了经典的A型构象，更利于碱基堆积力，因此LNA对DNA或RNA表现出极好的结合能力。

根据LNA添加的位置差异与寡核苷酸序列的不同，每掺入一个LNA，寡核苷酸的Tm值可提高3~9℃。LNA与DNA或RNA之间仍然遵循碱基互补配对原则。LNA的添加并非越多越好，比如过多的LNA可能造成寡核苷酸分子内部的杂交。

1）推荐将LNA应用于需要高特异性的杂交检测中：双标探针，原位杂交探针等。

例如在TaqMan PCR中，对于富含AT的序列设计探针可能出现Tm值不够的现象，使用LNA可以在不延长探针的前提下，提高探针Tm值，避免探针过长导致的高背景值。

有研究表明，利用qPCR做SNP（单核苷酸多态性）检测时，与普通引物相比，使用LNA修饰的引物在野生型序列和突变序列之间可得到更高的分离度（ΔCt）[8]。

图片来源：《Enhanced Allele-Specific PCR Discrimination in SNP Genotyping Using 30 Locked Nucleic Acid (LNA) Primers》

2）行使RNA抑制功能的寡核苷酸：ASO，siRNA。

应用：

N6-Me-rA就是我们经常听到的m6A，具体指的是腺嘌呤核糖核苷酸的腺嘌呤碱基第6位的N发生甲基化，是近几年热门的研究方向。m6A是一类在真核生物RNA中广泛存在的修饰，目前已经在mRNA、tRNA、rRNA和long non-coding RNA等非编码RNA中都观察到，这种修饰可影响RNA的剪接、翻译和稳定性等，从而在细胞分化、肿瘤发生和免疫反应等很多生物学过程中发挥重要的调控作用。

有研究表明，在环状RNA中引入m6A修饰可降低其免疫原性。

应用：

N6-Me-dA具体指的是腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的腺嘌呤碱基第6位的N发生甲基化。相比于m6A，N6-Me-dA是一种存在于DNA上的修饰，最初只在原核生物，特别是细菌中被检测到；近来研究表明，真核生物基因组中也存在N6-Me-dA的修饰。

在细菌中，N6-Me-dA调控细胞周期、DNA的错配修复、基因转录、抗生素耐药性和细菌与宿主间相互作用等[9]。

在高等真核生物中，N6-Me-dA的水平从胚胎发育时期最丰富到成体组织中显著降低，提示N6-Me-dA与发育、再生密切关联。近来也有研究表明，小鼠脑中N6-Me-dA的水平与小鼠所处环境压力相关。

应用：

5-Me-dC指的是5-甲基脱氧核糖胞苷，即在胞嘧啶脱氧核糖核苷酸碱基的第五位修饰甲基。5-Me-dC与dG碱基互补配对，该修饰提高了双链的稳定性，向寡核苷酸中每掺入一个5-Me-dC，寡核苷酸的Tm值可提高约1.3℃。

1）添加到较短的PCR引物中。在一些特殊情况下，PCR模板上引物结合位点有限，或者PCR模板的二级结构可能阻止引物的结合、扩增时，使用5-Me-dC修饰的PCR引物或许可以得到比较好的扩增效果[10]。

2）包含CpG基序的ASO给药到动物体内后，会激活Toll-like receptor 9（Toll样受体9）而引起比较大的免疫反应，研究发现用5-Me-dC替代dC则可以大幅减弱这种免疫反应[11]。

3）在真核生物中，5-Me-dC是最常见的DNA甲基化修饰；哺乳动物中，大多数5-Me-dC发生在CpG位点，并由DNA甲基转移酶将甲基转移到胞嘧啶上进行修饰；5-Me-dC在胚胎发育、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。

4）在cfDNA甲基化测序中，5-Me-dC可作为建库中使用的接头引物的修饰，用于分析DNA甲基化的情况。

应用：

1）ddC是一种双脱氧核糖核苷酸，属于脱氧胞苷（dC）的类似物。两者的区别在于dC核糖的2'位的羟基被H取代，而ddC核糖的2'和3'位的羟基均被H取代。因此ddC主要连接在寡核苷酸的3'端，用于阻止寡核苷酸向后延伸。

2）在miRNA测序建库中，使用5'-rApp修饰的寡核苷酸adapter，这类adapter的3'端修饰ddC，用以阻止adapter之间的互相连接或分子内的环化[12]。

图片来源：《Elimination of PCR duplicates in RNA-seq and small RNA-seq using unique molecular identifiers》

应用：

dU是嘧啶脱氧核糖核苷，属于尿嘧啶核苷的衍生物。在细胞中dU作为dC的脱氨产物产生，脱氨过程由AID酶催化。尿嘧啶DNA糖基化酶可以水解单链DNA或双链DNA中dU的糖苷键，释放尿嘧啶，产生缺碱基位点。使得寡核苷酸链容易断裂。

1）在qPCR中，dU可防污染：通过将PCR中的dT替换为dU，qPCR检测完成后，可使用尿嘧啶DNA糖基化酶将PCR产物降解，从而避免每次PCR之间造成的交叉污染。

2）有研究将dU掺入到探针中，用来进行短DNA片段的qPCR检测：将短DNA作为引物，含dU的探针作为模板，使短DNA片段进行延伸得到一个适合进行常规qPCR的长片段，再用尿嘧啶DNA糖基化酶将含dU的探针消化避免对后续qPCR的干扰，最终设计引物对包含短DNA的长片段进行qPCR检测[13]。

图片来源：《Real-time PCR method for detection of short DNA using a deoxyuridine probe and application for detection of fomivirsen》

应用：

dI即脱氧肌苷，属于核苷类似物，它在结构上类似鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，但碱基上缺少2-氨基；脱氧肌苷和A、T、C、G四种碱基均以两个氢键进行互补配对，因此脱氧肌苷经常被用作通用碱基。但是，脱氧肌苷对于A、T、C、G的结合能力存在差异，从热力学稳定性上I-C > I-A > I-G ≈ I-T，这种热力学的差异也会受到邻近碱基的影响。

1）在用混合引物进行PCR做突变时，为了考虑简并密码子的问题，经常需要设计很多引物，将dI添加到寡核苷酸密码子的第三位（摆动碱基），可以降低引物的复杂度。

2）在Dual priming oligonucleotide system（DPO，双引物寡核苷酸系统）的PCR中，dI以poly dI的形式起到linker作用。DPO系统的引物由三部分组成，较长片段的5’端序列Tm值较高，优先与靶标序列结合，稳定DPO引物与靶标退火步骤；继而较短片段的3’端结合至靶标序列上，启动特异性延伸；而连接5’和3’端的Poly-dI linker在引物退火过程中，会形成泡状结构，该探针通过使引物两步退火，确保引物启动特异性扩增[14]。

图片来源：《Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene》

应用：

rI在结构上类似鸟嘌呤核糖核苷酸，但碱基上缺少2-氨基；rI与A、U、C、G四种碱基进行互补配对。

在tRNA中rI存在于反密码子的摆动位置，这种修饰扩充了tRNA可识别的三联体密码子；在mRNA转录时或转录后可发生A-I的编辑，这种修饰影响了RNA的剪切和翻译；rI对mRNA和tRNA功能的综合作用使其成为翻译效率和准确性的主要调节剂，有助于物种间蛋白质组的多样性。

应用：

通过在寡核苷酸中引入inverted dT，寡核苷酸可以被设计成5'-5'或3'-3'连接。由于很多核酸酶作用于5'-3'磷酸二酯键，所以在寡核苷酸末端引入inverted dT可以抵抗核酸外切酶的降解。

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参考文献：

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[13] Harikai, N., Tanaka, Y., Miyashita, S., Zaima, K., & Shinomiya, K. (2022). Real-time PCR method for detection of short DNA using a deoxyuridine probe and application for detection of fomivirsen. BioTechniques, 73(6), 281–287.

[14] Chun, J. Y., Kim, K. J., Hwang, I. T., Kim, Y. J., Lee, D. H., Lee, I. K., & Kim, J. K. (2007). Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene. Nucleic acids research, 35(6), e40.