干货

打开Oligo 6软件，出现一个标着“Select Codon Usage Database”的对话框，不用管它，直接点取消，于是出现如下界面：

软件界面看着非常简单，菜单条只有四个选项，菜单条下面是一些快捷按钮，还有一些按钮是灰色的、按不动的。实际上，随着不同的操作，菜单选项和快捷按钮是会出现变化的。强大的功能就隐藏在这些变化的选项中。

要设计PCR引物，我们必须要有目的基因序列。这个序列在哪里输进去呢？很简单，点击按钮

，在打开的空白框里，我们可以把目的基因序列贴上去。比如，我们把人TP53基因（AB082923.1）的CDS区贴进去，就变成下面这样，同时可以发现菜单条选项忽然就变了，变了，变了。。。

点击

可以把贴进去的序列保存成seq文件。这里我们把这段序列命名为TP53。点击菜单第二个选项“Accept/Discard”，选中“Accept”，出现如下界面，而且菜单选项又变了，变了，变了。。。

在这个界面里出现了两个框，一个标着ΔG，一个标着Tm。标着Tm字样的这个框框左下部有两个按钮，分别写着“Upper”和“Lower”。Upper——Upper Primer，Lower——Lower Primer，好像跟引物有那么点关系。。。事实是，真的很有关系。。。所以设计引物我们只要看标Tm的那个框就好了。

PCR引物的长度为15-30bp，最常用23/24bp，我们可以先把需要的引物长度设定好。怎么设定呢？

点击菜单的“Change”选项，选中“Current Oligo Length”，弹出如下对话框：

填入数字24，点OK，引物的长度就设定好了。这时候软件默认你接下来选中的引物长度是24bp。

然后我们就用“肉眼”去搜索引物。

Tm图上标着3条平行的虚线，我们要寻找的是Tm值位于第2和第3条线之间的碱基，就是下图红色框的范围。

鼠标点击742bp处，碱基序列上的长方形框就会随着鼠标移动至742bp处，然后点击“Upper”按钮，字母颜色就变成红色，此时已经选中742bp处的序列为上游引物，同理选中下游引物（如果想更改下游引物长度，可以在选中下游引物前，进去change选项里改。如果不改的话，那这里的下游引物长度就还是24bp），点击菜单“Analyze”选项选中“PCR”，即弹出这对引物的各项参数，如下图：

那么怎么知道这对引物好还是不好呢？很简单，只要这张参数表的右下框里没！有！出！现！任何文字，那这对引物就是可用的！“Analyze”选项中还有很多其他评价引物的选项，那些都不用看！！！

然后，我们需要把引物序列输出。可以到file菜单中选择save去保存引物序列，但是这样保存下来的是seq文件，还得再打开了看，有点麻烦。所以猫大是直接进edit菜单，把引物序列复制黏贴到excel表，而且复制黏贴的序列会自动按5’-3’的顺序排列。

最后去blast一下，看是不是会扩增出其他基因。如果扩增不出，就可以去合成了。

有时候，选中的引物并不合适，框框里就出会出现讨厌的字，比如：

A．

引物间有二聚体，那就随意挑一条引物挪动几个碱基；

B．

有两个可用的温度，那就还是随意挑一条引物挪动；

C．

这说明了下游引物的一端稳定性太高，那就是说这条引物的碱基对应的柱子高了，把它往柱子低一点的地方挪；

D．

上下游引物的末端稳定性都太高，那就把两条都挪往低一点的地方去吧。

E．etc.

这个方法总结下来就是：

打开序列

▼

设置引物长度

▼

找Tm适中的碱基

▼

评价

这个软件用简单几个步骤就能一次性完成引物设计和引物评价两件事！

而且这么挑出来的引物都相当靠谱，基本没有引物二聚体。用熟练了会感觉自己自带X光眼，看哪儿、点哪儿，哪儿就是引物！可以跟同学吹牛皮说：引物不用设计，眼睛看看就行！

嗯，引物设计完毕，oligo官网：http://www.oligo.net/downloads.html有试用DEMO可以下载哦~

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合作微信：helixlife6返回搜狐，查看更多