植物干细胞培养研究进展

随着我国制药工业及功能性食品行业的迅速发展，对植物中活性成分的需求日益增长。植物中的活性成分具有抗衰老、提高免疫力及保护心脑血管等的作用[1]，但其质量受环境因素和收获条件的影响，活性物质产量低[2-3]，有些植物的活性成分仅限于特定的组织部位或生长阶段合成[4-5]。对于结构复杂、人工合成困难的活性成分，传统的愈伤组织培养方式虽然可以在短时间内生产有价值的产品[6]，节约了资源，但是经历脱分化的愈伤组织液泡化程度高，常常增加了细胞的异质性，对振荡培养的剪切力敏感，经多次有丝分裂后，容易产生DNA甲基化[7]以及转座子被激活[8]等变异现象，导致培养过程不稳定，天然产物的产量、性质不稳定等缺点，难以适应现代工业生产需求[9]。

干细胞的概念起源于20世纪60年代的动物胚胎学研究，其含义“具有自我更新复制能力和分化潜能的细胞”。与此相对应，植物干细胞实为传统植物解剖学范畴中的分生组织，包括茎尖分生组织(Shoot apical meristem)、根尖分生组织(Root apical meristem)、侧生分生组织[10]以及部分髓射线细胞，其具有产生所有分化细胞类型的能力[11]以及旺盛的分裂能力和较高的遗传稳定性。植物干细胞具有多个小液泡、线粒体活性高、聚集度低[12-13]、细胞壁无木质素沉积[14-15]等特点，低温保藏后仍维持较高的细胞活性，在悬浮培养过程中大部分以单细胞形式存在，对剪切力不敏感，能维持稳定的增殖速度，可以长期稳定培养。2010年，Lee等在Nature Biotechnology上成功报道了红豆杉形成层干细胞的分离及3 t生物反应器培养研究[16]，随后越来越多种植物的干细胞研究被报道，本研究在总结上述研究结果的基础上，对当前植物干细胞的分离、培养、鉴别及应用情况进行综述，并对植物干细胞培养的前景进行了展望，为该领域的深入研究提供参考。

植物干细胞处于未分化状态，其分离方法是建立在传统的组织培养基础上，具体步骤包括：1)含分生组织的外植体消毒处理；2)干细胞的诱导；3)分离并收集干细胞；4)干细胞的鉴定。目前关于植物干细胞的诱导和大规模培养等研究报道较少，植物干细胞培养仅见于形成层干细胞、茎尖干细胞及根尖干细胞培养。

目前关于贮藏根形成层的培养，仅见于胡萝卜、人参及当归。具体包括：外植体的消毒、抗褐化培养、渗透处理以及诱导培养获得形成层干细胞系。在实际培养过程中渗透处理对形成层干细胞系的获得尤为重要，所选用的渗透剂以及渗透剂的浓度至关重要，实际操作过程中0.6 mol/L蔗糖效果最佳，使对渗透压敏感的非形成层组织坏死，而对渗透压不敏感的干细胞保持活性。处理后的外植体置于诱导培养基上，一段时间后，所得细胞系即为干细胞系[17]。渗透剂一般为蔗糖溶液，也有用KCl、甘露醇等作为渗透剂的报道[18-19]。干细胞诱导之初对植物激素的要求相对严格，有报道表明诱导初期用IBA或IAA，而其他激素无效果，继代培养基中一般添加2, 4-D即可。基于上述方法，人参、胡萝卜以及当归细胞系均已成功培养[17, 20]，并且建立了当归和人参细胞的气升式反应器，人参形成层细胞与愈伤组织相比，倍增时间为3−6 d，而愈伤组织的倍增时间为28 d，生长速度提高了5−9倍，人参皂苷的含量(Re、Rb1、Rb2和Rd)尤其是在野山参中达到了3%。该细胞系提取物可以抗肿瘤、提高免疫力，并且还具有抗氧化、抑制皱纹产生的效果[17]。当归干细胞悬浮培养21 d后，鲜重增长为2.83倍，愈伤组织为1.67倍，同时当归干细胞合成次级代谢产物活性较强，干细胞阿魏酸含量为9.118 mg/kg，而在愈伤组织中未检测到阿魏酸[20]。

笔者在实验过程中发现进行人参形成层干细胞的分离时有的材料自带内生菌，会对实验过程造成干扰，需要在实际的分离过程中选择合适的消毒方法以及培养条件，一般选择在干细胞诱导培养基中加入抗生素处理；另外，可能由于品种不同，形成层干细胞诱导的条件不同，实验过程中需要针对特定的品种摸索具体的实验条件，才能保证成功获得干细胞系。

采集的枝条置于抗坏血酸溶液中防止氧化，外植体常规消毒后，尽量去除韧皮部等非形成层组织，将含有形成层的组织切分后置于含有IAA或NAA的诱导培养基上，一段时间后形成层细胞自然分层，收集细胞继代培养。研究者们利用上述方法成功获得了银杏及红豆杉干细胞系[21-22]，所获得的干细胞系建立了大规模的悬浮培养体系，银杏干细胞最终建立了250 L的气升式反应器，且干细胞干重达到了11.7 g/L，其提取物可以清除自由基，具有强烈的抗氧化作用，在制药、功能性食品领域具有较强的工业实用性。在红豆杉干细胞悬浮培养方面，气升式反应器中干细胞增长明显优于愈伤组织，3 L生物反应器中培养4个月后，来自针叶和胚胎的愈伤组织(Callus)干重分别为3.33 g和5.08 g，而干细胞(Stem cell)干重为3 819.44 g。并且3 L反应器中，加入诱导子50 mg/L壳聚糖和100 μmol/L茉莉酮酸甲酯，以及0.1 mmol/L的前体苯丙氨酸处理后的愈伤组织紫杉醇含量分别达到了11 mg/kg和13 mg/kg，而干细胞中紫杉醇含量达到了98 mg/kg，明显高于愈伤组织中紫杉醇含量，经过研究人员对培养参数的筛选和优化，建立了3 t红豆杉干细胞生物反应器，实现了大规模工业生产[16]。

除此之外草本植物干细胞也有相关报道，韩国建国大学Moon等基于上述方法建立了长春花干细胞系[23]，结果表明，含有1.5 mg/L NAA和0.5 mg/L KT的B5培养基中长春碱含量达到最大值(0.794 mg/g)，含有1.5 mg/L NAA和1.5 mg/L KT的B5培养基中长春新碱的含量达到最大值(0.279 mg/g)。不仅如此，韩国云火公司的Lee和Jin等已经成功获得了番茄和菊花以及艾蒿干细胞，并建立了气升式生物反应器，3 L反应器中，番茄干细胞的生长速率达到了6.3倍，而愈伤组织的生长速率只有1.9倍，在250 L的气升式反应器中干细胞的干重达到了12.6 g/L，番茄干细胞的提取物可以促进原胶原的形成，抑制胶原分解酶的形成，起到了抑制皱纹的作用[24]。菊花干细胞在3 L反应器中培养14 d后，细胞由最初的4.1 g/L增长到了11.8 g/L，干细胞系提取物不仅具有抑制由脂多糖处理引起的NO产生的效果，而且还具有抑制环氧化酶-2 (Cyclooxygenase-2，COX-2)表达的效果，因此该细胞系可用于生产消炎药及功能性饮料[25]。

关于茎尖干细胞的分离培养仅见于拟南芥茎尖干细胞和芦荟茎尖干细胞。不同于其他草本植物，芦荟干细胞挑选幼嫩的茎尖作为外植体。常规消毒后，切取茎尖，置于含有NAA和6-BA的诱导培养基中培养。获得的细胞团用0.25%的纤维素酶和0.25%的果胶酶进行酶解，所得到的细胞即为干细胞[26]，该细胞系冻干粉中芦荟苷含量达到了150.80 mg/g，显著增加了芦荟苷的含量。

干细胞系的获得，除了常规诱导方面，也有通过转入抗性筛选基因进行干细胞系建立的报道，厦门大学沈宏通过该方法建立了拟南芥茎尖干细胞系[27]。

根尖干细胞的诱导：首先将去除根冠的根组织切分成1 mm大小，置于含有2, 4-D的诱导培养基上，暗培养一段时间后，静止中心细胞继代于含有2, 4-D的培养基上扩增，利用该方法获得了水稻干细胞[28]。在此基础上暨南大学的王一飞等建立了铁皮石斛的干细胞系，并建立了10 L的悬浮培养体系，利用超低温冷冻、超声波破碎以及真空干燥等方法制备了铁皮石斛干细胞冻干粉，铁皮石斛干细胞提取物具有较高的POD (Peroxidase)、SOD (Superoxide dismutase)以及CAT (Catalase)酶活性，具有较强的抗氧化作用，干细胞冻干粉对成纤维细胞的光老化具有抑制作用，提高了其SOD酶活性，其制备的眼霜还具去除眼袋和淡化黑眼圈的效果[29]。

植物干细胞具有多个小液泡、线粒体活性高[12-13]以及细胞壁不含木质素[14-15, 23]等特点，在干细胞鉴别方面，主要依据其自身特点对一些特定的细胞器进行染色观察，以此区别于愈伤组织等非干细胞系。目前常用的染色方法有如下几种：1)中性红液泡系染色；2)间苯三酚木质素染色；3) Janus green B线粒体染色。除此之外，与愈伤组织相比，在干细胞中存在特异表达或高表达的基因。

中性红是液泡特殊的活体染色剂，由于液泡呈酸性，进入液泡的中性红解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，所以通过液泡染色可以区别干细胞系。

韩国云火公司Lee等诱导培养红豆杉形成层细胞后，对干细胞进行了中性红染色，结果表明，形成层细胞内具有多个被染色的红色小液泡，而愈伤组织细胞内呈现出一个中央大液泡[16]，在人参以及菊花干细胞中也观察到具有多个小液泡的现象。实际操作中发现在干细胞组织学染色过程中，中性红染色使用PBS (Phosphate-buffered saline)比Ringer溶液(Ringer’s solution)染色效果好。

间苯三酚反应是确定木质化细胞壁最常用的方法，间苯三酚在酸性环境下与细胞壁中的木质素发生樱桃红色或紫红色反应。

Moon等将诱导出来的长春花形成层细胞与愈伤组织细胞进行间苯三酚染色，结果表明，形成层细胞无盐酸-间苯三酚染色反应，而愈伤组织细胞发生紫红色染色反应。这一结果表明，愈伤组织细胞的细胞壁有木质素沉积，形成层细胞无木质素沉积为初生壁[23]。笔者在实际操作过程中发现间苯三酚染色过程中，盐酸的浓度对染色效果影响很大，研究发现低浓度盐酸显色效果欠佳，0.5 mol/L以上盐酸浓度显色效果较好。

Janus green B对线粒体专一性染色，由于线粒体中的细胞色素氧化酶的作用，使Janus green B始终保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原成无色。干细胞具有较高的线粒体活性，所以经Janus green B染色可以区别干细胞系。研究者利用Janus green B对银杏和番茄形成层细胞线粒体进行染色，银杏细胞线粒体染色结果显示出愈伤组织线粒体较少，而形成层细胞短棒状线粒体较多，可以为细胞的增殖和分化提供能量[21, 24]。笔者在试验过程中发现，针对线粒体的染色常规的操作是将材料完全浸没在染液当中，而对于干细胞系来说，这样的处理结果并不理想，进行少量多次滴加染液效果更好。

在植物干细胞中，存在一些特异表达或高表达的基因。ATHB-8 (ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX 8)被认为是原形成层细胞的分子标记，在形成层细胞特异表达，可以保护原形成层前体细胞不受极性生长素流(AUXIN flow)的干扰而保持形成层细胞的稳定性[30-31]。WOX4 (WUSCHEL HOMEOBOX RELATED 4)基因主要在形成层中表达，形成层中存在TDIF (Tracheary element differentiation inhibitory factor)多肽，具有抑制形成层细胞分化并且促进细胞增殖的功能，与受体激酶PXY (Phloem intercalated with xylem)胞外结构域特异结合形成TDIF-PXY通路促进WOX4的表达[32]，并且在形成层分生组织中还存在PIN1 (PIN-FORMED1)以及HAM4 (HAIRY MERISTEM4)等上调表达基因[32-34]。最近研究表明，维管形成层分生组织中AVB (ABNORMAL VASCULAR BUNDLES)基因参与维持侧生原基发育中的正常细胞分裂模式，是形成层细胞所必需的[35]。

CLV3 (CLAVATA3)作为茎尖干细胞分子标志基因，在分生组织细胞表达，可促进分生组织细胞增殖，WUS蛋白通过胞间连丝运输到干细胞区域[36]，直接与CLV3启动子结合，抑制CLV3的表达，从而抑制干细胞的增殖，二者构成CLV-WUS负反馈调节通路[37]，以维持干细胞的数量稳定。最新研究发现CIKs (CLAVATA 3 INSENSITIVE RECEPTOR KINASES)受体激酶作为受体通过磷酸化传递CLV3的信号，抑制WUS的表达，从而维持茎尖分生组织的平衡[38]。

WOX5 (WUS RELATED-HOMEOBOX 5)特异性地在根尖静止中心细胞中表达，抑制干细胞的分化，在根尖中CLE40 (CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION40)蛋白在干细胞和中柱细胞中表达，通过ACR4(ARABIDOPSIS CRINKLY 4)受体传导CLE40的信号，抑制WOX5的表达，促进干细胞的分化，以维持根尖干细胞的稳定[39-41]。在根尖干细胞中还存在QC25 (Quiescent center)以及QC46[42-43]等特异表达的基因，近年研究表明在根尖干细胞中存在RGF (Root meristem growth factor)小肽[44]，RGF的受体RGFRs (RGF receptors)和RGI (RGF1 INSENSITIVES)能够响应RGF信号，促进PLT (PLETHORA)转录因子的表达，PLT可促进分生组织细胞的分裂，以维持根尖分生组织稳定[45-47]。

早在2003年研究者开始对根尖干细胞的表达谱进行了分析，结果表明在根尖干细胞区域存在差异表达基因[48]，韩国的Lee等通过基因表达谱比较了红豆杉形成层细胞和愈伤组织细胞的差异，确定了563个基因在形成层细胞中表达不同，其中296个基因呈现正调控[16]。Yadav等对茎尖干细胞的表达谱也进行了分析，结果表明茎尖干细胞中，在CLV3表达区域还存在AIL5、AIL6 (AINTEGUMENTA-LIKE)等特异表达的基因，但这些基因的功能有待进一步研究[49-50]。

植物干细胞培养克服了传统组织培养中培养物对剪切力敏感、次生代谢产物低、遗传不稳定等问题。与愈伤组织相比，植物干细胞在长期培养条件下可以维持稳定的增殖速度，在食品、药品及化妆品行业具有更广阔的应用前景。研究表明经干细胞培养后提取的有效成分在治疗艾滋病、抑制黑色素瘤、治疗肝炎、抗氧化和抗衰老、抑制异常的细胞凋亡、杀伤癌细胞等方面都具有很好的疗效[22-23, 51-56]。

韩国在植物干细胞诱导及培养方面积累了丰富的经验，已报道了人参及野山参、长春花、红豆杉、银杏、菊花等药用植物形成层干细胞的诱导、培养、鉴定、大规模发酵培养、培养物活性成分分析等[16-17, 21, 23, 25]。我国的科学家们在该领域的研究也取得了丰硕的成果：严春燕等分离并培养了当归干细胞[20]；厦门大学沈宏等分离培养了拟南芥茎尖干细胞[27]；暨南大学王一飞等用铁皮石斛干细胞冻干粉生产的眼霜具有明显的抗衰老效果[29]；曾宪卓等通过分离并培养芦荟茎间干细胞，测得芦荟干细胞冻干粉中芦荟苷的含量显著提高，达到了150.80 mg/g，为医疗、化妆品和功能性食品行业提供了良好的基础[26]；功能性食品方面，陈海佳等制备的苹果干细胞冻干粉可以作为胃肠道保健食品[57]；林淑芳等利用番茄干细胞冻干粉制备了口服液、饮料和白酒，研究结果表明，其制备的产品具有抗氧化、预防癌症、降血压、降低胆固醇以及调节免疫力的效果[58]。

植物细胞不受动物病原体的污染，生产成本较低，并且植物干细胞培养具有诸多优势，利用基因工程手段，以植物干细胞作为受体生产抗体、疫苗以及其他蛋白药物也将会在生物药物生产中被广泛应用。在实际培养中关于植物干细胞分离和鉴别方面还存在很多不足，外植体诱导出细胞后，如何精确分离干细胞，保证干细胞的纯度，以及建立规范的鉴定体系是目前干细胞培养面临的主要问题。