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鼠肺炎病毒探针法荧光定量RT
鼠肺炎病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
产品名称：鼠肺炎病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
规格：50T/盒
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【产品简介】：
小鼠肺炎是由肺炎病毒（Pneumonia Virus of Mice）引起的小鼠、大鼠等啮齿动物的感染性疾病。本病是啮齿动物最常见的病毒性疾病之一。小鼠肺炎病毒属于副黏病毒科肺病毒属的一种热不稳定性肺病毒，基因组为单分子线状负链单股 RNA，胞浆内复制，细胞外膜出芽，病毒凝集几种啮齿类动物红细胞，病毒专门在呼吸道内复制，并在感染后 6-8 天在肺脏内达到峰值。病毒可引起小鼠、大鼠、仓鼠及其他啮齿动物自然感染，兔、猴、人也可感染。感染在小鼠中广泛流行，并且分布于全世界，但在一个给定的鼠群中，不如仙台病毒感染迅速，小鼠肺炎病毒是一种急性、自限性感染，需要小鼠之间密切接触才能有效传播。自然感染呈严格的嗜肺性，通常无明显临床症状，严重感染可见消瘦、弓背，呼吸急促，引起慢性鼻炎，间质性肺炎，试验性感染小鼠可见体重下降，倦怠，并有肺炎的临床症状。鼠肺炎病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测鼠肺炎病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据鼠肺炎病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的 RNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。
【检验原理】：
本试剂盒采用TaqMan探针法实时荧光PCR技术，设计一对鼠肺炎病毒特异性引物，结合一条特异性探针，用一步法荧光RT-PCR技术对鼠肺炎病毒的核酸进行体外扩增检测。
【包装规格及成分】：
编号
成分
规格
试剂一
鼠肺炎病毒扩增液
50μL×1管
试剂二
鼠肺炎病毒反应液
950uL×1管
试剂三
鼠肺炎病毒阳性质控品(5.59E+04)
50μL×1管
试剂四
鼠肺炎病毒阴性质控品
50μL×1管
产品说明书
1份
注：
不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
自备：无DNA/RNA酶的1.5mL离心管，0.2mL PCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL,200μL,1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。
禁止与其他品牌/自配的试剂混用，否则会影响使用效果。
【储存条件及有效期】：
1.试剂盒应置于-15℃以下冷冻避光储存；有效期12个月，采用泡沫盒加生物冰袋密封运输，温度不超过8℃，生产日期及有效期详见外包装盒。
2.试剂盒避免反复冻融，冻融次数不超过5次，开封后-15℃以下冷冻避光储存，不影响有效期内使用。
【适用仪器】：
ABI、安捷伦MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列荧光定量PCR检测仪。
【标本采集】：
1.根据实际情况可采取病毒/组织/血液等样品1g作为检测样本
2.应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。
【样本保存及运输】：
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过6个月，标本运送应采用2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】：
1.样品处理（样本处理区）
1.1样本前处理
1)组织样品：每份组织分别从3个不同的位置称取样品约1g，手术剪剪碎混匀后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心管中，8000rpm离心2min，取上清液100μL于1.5mL灭菌离心管中；
2)全血样本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL灭菌离心管中。
1.2核酸（RNA）提取
根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化病毒DNA/RNA提取试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。
推荐采用我们公司研发生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒
2.试剂配制（试剂准备区）
2.1从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。
2.2根据待检测样本总数，设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满7份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂
鼠肺炎病毒反应液
鼠肺炎病毒扩增液
用量（样本数为N）
19μL
1μL
2.3在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后2000 rpm离心10 s，按照20μL/管分装量将试剂分装至八联PCR反应管中。
2.4盖紧八联PCR反应管盖,并注意做好相应标识（请标记在八联PCR反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联PCR反应管盖中间，以免影响信号采集）。将PCR反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3.加样（样本处理区）
将步骤1.2提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。
4.PCR扩增（核酸扩增区）
4.1将待检测反应管置于荧光定量PCR仪反应槽内,并记录放置顺序；
4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为25μL；
4.3荧光通道选择：检测通道选择FAM，淬灭通道选择NONE，参比荧光选NONE。
【推荐循环参数设置】：
步骤
循环数
温度
时间
收集荧光信号
1
1 cycle
50℃
15min
否
2
1 cycle
95℃
3min
否
40 cycles
95℃
15sec
否
55℃
30sec
是
5.【结果分析判断】
5.1结果分析条件设定
设置Baseline和Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节Baseline的start值(一般可在3~15范围内调节)、stop值(一般可在5~20范围内调节)，以及Threshold的Value值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2结果判断
l阳性：检测通道Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。
l可疑：检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤38.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
l阴性：检测结果Ct值无Ct值，无明显的扩增曲线。
6.【质控标准】
l阴性质控品：无明显扩增曲线或无Ct值显示；
l阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct值≤30；
l以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7.【产品性能指标】
l阴阳性参考品符合率：5份阳性参考品符合率为100％；10份阴性参考品符合率为100％。
l最低检测限：1.0×103copies/mL。
l精密度：批内、批间精密度检测Ct值的变异系数（CV）均小于等于3%。
【厂家信息】：
Ø 公司名称：上海博尔森生物科技有限公司
Ø 网址：www.bioesn.net
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