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知乎大神分享经验

我之前连过一个片段，大概有 4000bp 左右，一直连不上。有一次我看到板子没长菌后，就没收，继续扔到温箱了。36h后，它长菌了。阳性率还挺高。

后来我做同源重组，过夜后不长菌的板子我就继续扔到培养箱再过夜，每次都连上了（有时候培养时间接近48h）。屡试不爽。后来我还把这个方法传授给了我的同门。至于同源臂，一直用的都是19bp。其实只要片段and载体的浓度比例正确，一般都是没有问题的。二者最好不要浓度太低，类似个位数的ng/uL（no!! 多切或者多p几管呀）。碰到难连的片段，首先考虑引物设计问题，载体线性化成功与否，片段与载体比例是否恰当（一般3：1），感受态的问题。如果经常做分子克隆，毕竟都是用的同一批次，出问题的概率应该比较小。最后：1. 摇菌时间可以稍微延长至2-3个小时（像如果实验室人员比较多，你其实并不清楚有没有人中间把摇床停了）。2. 重新连，跟板子扔在温箱继续培养同步进行。试试我的方法。3. 也是最最重要的一点，板子记得处理，保持好习惯才能有好结果。All！补充：楼上有一点说的没错，片段特异性也非常关键。同样大小的未必是你的条带。建议测序以证清白。

测序假阳性，检查试剂板子是否污染。

如果空载情况：检查载体，同源臂设计情况。

阳性筛选检测的时候换引物检测。

诺唯赞官方账号解答

相信各位经常进行分子克隆实验的小伙伴对载体构建实验非常熟悉，通过这项实验，我们能够将自己期望的DNA片段组装到目的质粒，随后经过感受态细胞转化等操作得到重组质粒。实现载体构建的技术方法有多种，如酶切连接法、Gateway克隆、同源重组克隆等，其中Vazyme同源重组方法以其简单、快速且高效的特点，帮助了众多小伙伴顺利完成了载体构建实验。但实验的道路不总是一帆风顺，也会碰到许多问题，其中最常见的是涂板不长克隆。

今天小V带着大家一起探讨这类问题的分析和优化策略，帮助大家在遇到时，能够更好更快的找到原因并合理改进实验。

首先，分析引物设计、线性化载体及目的片段

01引物设计

✦建议同源臂长度15-20bp（酶切位点序列不包含在内），GC含量40-60%，超出范围会影响重组效率

以下图为例解析单片端同源重组引物的设计原则：

载体pUC19，使用限制性内切酶EcoR I、Hind III双酶切方式线性化

灰色框内序列组成：同源重组的同源臂+酶切位点

同源重组引物设计原则（如下图所示）

✦推荐使用CE Design引物设计软件，选择对应模块，按要求输入序列完成引物设计

软件可从下述几种途径获取：

1.登录Vazyme公司官网（http://www.vazyme.com），选择生命科学→资源支持→常用工具→实验工具→CE Design引物设计软件

2.复制链接

https://crm.vazyme.com/cetool/singlefragment.html

02线性化载体和插入片段

线性化载体和插入片段的长度范围及制备方式

✦插入片段和线性化载体，推荐使用切胶回收方式进行纯化回收（切胶时间最好控制在3min内）。

✦使用Nanodrop/Onedrop等仪器检测核酸浓度。若浓度小于20ng/μl，建议多做几管，合并在同一管回收，提高浓度

注：通过凝胶电泳将片段条带与DNA Marker条带的亮度比对估算条带浓度，若实验室的核酸染料为EB染料，可以判断；若为EB替代物，尤其Gelred等大分子核酸染料，不建议使用该方法。Gelred等大分子染料的浓度线性范围和EB不同，对核酸浓度的分辨率不高，不同浓度的核酸条带亮度差不多。

其次，分析重组反应体系和操作

01重组反应体系

✦线性化载体和插入片段的使用量

线性化载体和插入片段的最适使用量计算及使用量范围

注：线性化载体和插入片段的区分依靠长度判断，长度最长的片段为线性化载体，其余为插入片段；若计算得到的最适使用量超出对应使用量范围，则使用对应范围的极限值。

✦重组体系各组分的投入体积最好≥1μl

若投入体积10kb质粒转化。

✦重组产物与感受态细胞用量

重组产物体积：感受态细胞体积=1：10，推荐10μl重组产物+100μl感受态细胞。

02涂板操作

✦抗生素抗性：平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致。

✦菌液涂板体积：建议将菌液离心，移液枪吸取丢弃多余LB培养基，保留100μl重悬，全部涂板。