你懂荧光定量PCR吗？要点一二三帮你解惑

荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR），简称Q-PCR，是一种在扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物的总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定基因序列进行定量分析的方法。

Q-PCR三个重要指标

1

扩增及溶解曲线

扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映Q-PCR的动态进程。

溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，溶解曲线就会出现单峰；如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个峰。

2

荧光阈值

一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光域值设定在PCR扩增的指数期（分为基线期、指数期以及平台期）。

3

Ct值

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

Q-PCR数据分析·2-ΔΔCt法

内参基因Ct值归一目标基因Ct值：

ΔCt(test)=Ct(target, test)-Ct(ref, test)   

对照样品ΔCt值归一实验样品ΔCt值：

ΔΔCt=ΔCt(test)-ΔCt(control)

计算相对表达量：

相对表达量=2-ΔΔCt

常见问题分析

Ct值多少才算理想

一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的，30以上基本可以说明该基因没有扩增，但也不是绝对的，需要辅以溶解曲线或电泳结果加以解释；

无Ct值出现

一般是由于模板不足或降解，亦或是引物降解；

Ct值特别低，扩增曲线很早起峰

模板的起始浓度过高，可以降低模板浓度；

Ct值很高，超过30以上

扩增产物过大或模板降解，亦或是PCR反应条件不够优化；

包括内参在内的基因的溶解曲线都出现双峰

这样一般都是由于有DNA的污染。

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