实时荧光PCR

图一. 荧光共振能量转移原理图

实时荧光PCR技术种类

染料法

SYBR Green I是一种比较常见的荧光染料，可以非特异的结合双链DNA小沟，它可以嵌合进DNA双链，但不结合单链。当SYBR Green I在溶液面未结合双链DNA时，仅产生很少的荧光，当它结合双链DNA时，就发射出很强的荧光信号。由于SYBR Green I能和任何双链DNA结合，无法区分引物二聚体或非特异性扩增产物，一般需要配合熔解曲线分析来排除假阳性。

图二. SYBR Green I作用原理

TaqMan探针

TaqMan探针是一个与模板特异性结合的荧光探针，它的 5'端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，3'端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整的时候，荧光基团和淬灭基团距离很近，使得荧光基团发射的荧光被淬灭。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5'-3'外切酶活性会切割探针，释放的5'端报告基团游离于反应体系中，它不受 3'端荧光淬灭基团影响，荧光信号就可以被仪器检测，积累荧光。也可以说每扩增一条DNA链，就形成一个荧光分子，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成同步。该技术目前应用较为广泛，包括人或动物病原体检测、生物制品鉴定等领域。

图三. TaqMan探针作用原理

双杂交探针

双杂交探针(dual hybridization probe)实时荧光PCR就是在两条寡核苷酸杂交探针上分别标记荧光供体基团和荧光受体基团，两基团的激发光光谱有一定程度的重叠。对两条探针的要求是，其与靶核酸的杂交位置应相互邻近。当两条探针与靶基因同时杂交时，两个荧光基团靠得很近，其间的距离在1~10 nm(通常为1~5个碱基)，依据FRET原理，在供体基团一定波长的激发光作用下，发生能量传递，从而激发受体基团发射另一种荧光，荧光强度和PCR反应中DNA合成量成正比。由于两个不同的探针必须杂交到正确的靶序列时，才能检测到荧光，因此，该方法的特异性增强。

图四. 双杂交探针作用原理

分子信标

分子信标(molecular beacon, MB)探针由两端分别共价标记有荧光基团和淬灭基团的单链DNA分子组成，分子信标的环部分和靶核酸互补，而探针的两头由于互补而成为茎。当分子信标为茎环结构时，淬灭基团和荧光基团距离很近，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收，从而抑制报告基团产生荧光。在PCR变性阶段，该探针的茎部打开形成一条单链，当溶液中存在特异性模板时，在复性阶段该探针即可与模板杂交，使得5'端荧光基团和3'端淬灭基团分离，荧光信号得以释放。该方法可以用于基因定量分析、疾病基因检测和诊断等。

图五.分子信标作用原理

蝎型探针

蝎型探针(Scorpions Probes)由探针、引物以及PCR终止子组成。探针部分和分子信标相似，也是5'端有一个荧光基团，3'端有一个淬灭基团，并且呈现茎环结构，与分子信标所不同的是，蝎形探针带有一段特异引物，可与相应的靶核酸结合，在Taq DNA聚合酶的作用下聚合延伸，得到扩增产物，而所带探针部分正好可以与延伸端的特异产物中互补序列杂交结合，因此，如有扩增存在，在不断变性复性过程中，蝎形探针即可不断与扩增子杂交，茎环结构打开，荧光基团不再被淬灭而被发射出来，荧光强度与扩增产物的含量呈正比。蝎形探针中特异探针序列呈环状结构，由一个不可扩增的单体即PCR终止子连接于PCR引物的5'端，PCR终止子可防止扩增蝎形探针的茎环部分。

图六. 蝎型探针作用原理

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