ATP7B基因敲除细胞

原标题：ATP7B基因敲除细胞——研究肝豆状核变性疾病的好助手

肝豆状核变性（hepatolenticular degeneration），又称威尔逊病（WD），是一类罕见的常染色体隐性遗传的铜代谢紊乱疾病，致病基因是ATP7B。ATP7B基因定位于13号染色体（13q14．3），编码一种1411个氨基酸组成的铜转运P型ATP酶。ATP7B基因突变导致ATP酶功能减弱或消失，引致血清铜蓝蛋白（ceruloplasmin，CP）合成减少以及胆道排铜障碍，蓄积在体内的铜离子在肝、脑、肾、角膜等处沉积，引起进行性加重的肝硬化、锥体外系症状、精神症状、肾损害及角膜色素环(Kayser- Fleischerring，K．F环)等，从而引起肝豆状核变性。WD的世界范围发病率为1/30 000～1/100 000，致病基因携带者约为1/90。在亚洲地区,最普遍的类型是R778L, 但是对于该类突变的发病机制尚不清楚。本病在中国较多见。WD好发于青少年，男性比女性稍多，如不恰当治疗将会致残甚至死亡。WD也是少数几种可治的神经遗传病之一，关键是早发现、早诊断、早治疗。

MT1X诱导和铜螯合的联合疗法为治疗威尔逊病提供有效思路。

目前Cu螯合剂和锌盐是治疗威尔逊病患者最重要的两种药物。然而，这些药物与ATP7B表达相关的分子机制尚未确定。在Gursimran的研究中，利用被广泛使用的人肝癌细胞系HepG2构建ATP7B基因敲除细胞系，用于该疾病的发病机制和治疗的分子研究。与亲本细胞相比，KO细胞显示出相似的生长、Cu摄取、释放和基因表达情况。然而，由于Cu的存在，研究人员观察到KO细胞形态变化、氧化应激、细胞凋亡和活力丧失。暴露在Cu中后，金属硫蛋白 (MT1X) 的诱导在KO细胞中显著降低。但在经过锌处理后，MT1X被强烈诱导表达，大部分KO细胞能够从铜诱导的毒性中被解救出来。D-青霉胺处理对KO细胞的活力影响很小，但在亲代细胞系中能显示出明显的改善。联合治疗在KO细胞中显示出高度协同作用。试验数据表明，锌对敲除ATP7B的肝细胞的生存能力具有从前未被认识到的影响，这是因为MT1X的高诱导表达补偿了Cu暴露后的低基因表达。因此同时针对MT1X诱导和铜螯合的联合疗法可提高肝细胞的总体存活率，从而为威尔逊病患者提供最有效的治疗思路。KO细胞在这个研究中起到了重要的作用，目前源井生物独家KO细胞库有近2000种细胞，数千种基因覆盖8大信号通路、热门免疫筛查点及以癌症肿瘤为主的疾病！

使用ATP7B KO细胞系验证Cu影响肠道细胞脂质代谢的稳态。

在另一个研究中，Guttmann等学者为了确定肠道细胞中Cu和脂质稳态和代谢的关系，在人肠道Caco-2细胞中构建ATP7B敲除细胞株。用含有核酸内切酶Cas9和导向RNA的质粒转染Caco-2细胞，靶向人ATP7B外显子2。结果显示KO细胞对Cu的敏感性增加，细胞内Cu储存增加，并诱导调节氧化应激的基因。乳糜微粒结构蛋白ApoB48在KO细胞中被Cu显著下调。敲除ATP7B基因后，载脂蛋白ApoA1、ApoC3和ApoE被既定地诱导。Cu使小尺寸脂滴的形成增强了，大尺寸脂滴的形成减少了。同时，Cu降低了甘油三酯 (TG) 的储存和分泌。KO细胞暴露于油酸 (OA)中导致TG储存增强。研究结果表明，Cu抑制肠道TG脂肪生成，而 ATP7B的缺失导致OA诱导TG储存。

应用CRISPR/Cas9技术构建模拟ATP7B基因R778L和P992L点突变小鼠模型。

董健健等研究人员通过CRISPR/Cas9技术，靶向中国WD患者ATP7B基因的常见突变位点Arg778Leu和Pro992Leu以显微注射技术向小鼠单细胞期胚胎注射Cas9 mRNA，最终成功构建了模拟ATP7B基因R778L和P992L点突变的小鼠模型。研究人员从生理和病理角度观察了这两种突变小鼠临床表型，验证了它们的表型与WD患者临床症状的契合程度。发现了R778L点突变小鼠血清中全铜蓝蛋白水平显著低于野生型小鼠,R778L和P992L小鼠血清中非铜蓝蛋白结合铜，及肝脑组织中铜的含量则显著高于野生型小鼠；同时，这些小鼠呈现肝脏病理性损伤，而R778L小鼠则伴有行为学异常。此次研究精确构建了针对中国人群WD的点突变小鼠动物模型，为WD发病机制及基因治疗研究提供了理想的工具。

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