基因串联策略强化枯草芽孢杆菌终止子的功能及其在基因表达中的应用

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitles)是典型的革兰氏阳性模式菌株，由于其具有极强的分泌能力和温和的生长条件，已被作为重要的底盘微生物，广泛用于N-乙酰基葡萄糖胺[1]、Leech hyaluronidase (LHAase)[2]、poly-γ-glutamic acid[3]等重要工业酶和高值平台化合物的生物合成中。这一应用需要在底盘中构建各种各样复杂的基因线路来执行生物合成的功能。目前在构建基因线路时普遍使用的生物部件有各种类型的启动子[4]、5'非翻译区调控序列[5]、核糖体结合位点(RBS)[6]、核糖开关和小RNA[7]、终止子和抗终止子[8]等。在大肠杆菌中，这些生物元件发展得最为充分，并且经过了长期验证和调试，已经能够实现按需所取，即插即用[9]。而在枯草芽孢杆菌中研究最多的是引导转录起始的启动子元件。长期以来的研究已发展出组成型、诱导型、自诱导型等种类丰富的元件，如P43、Pveg组成型启动子，PxylA木糖诱导型启动子，以及PsrfA自诱导型启动子等[10-12]。另外，在翻译水平上的调节可以通过设计新型核糖开关[13]，以及优化RBS序列来实现[14]。然而，与大肠杆菌相比，虽然在基因表达元件设计和开发方面有一定进展，但其他类型的调控元件种类匮乏，并且标准化程度不高，急需扩大基因调控元件库，突破在这一底盘细胞中设计复杂基因线路的瓶颈[15]。

终止子作为转录终止不可缺少的元件，可以防止错误表达反义转录产物干扰正常基因表达、提供3'末端调节转录的结构、提高RNAP利用率，同时还可提高mRNA的稳定性，增强上游基因的表达等[16]。因此，越来越多的研究表明，终止子在设计的基因线路中对调节各模块基因表达起着重要的作用。细菌中的天然的转录终止可分为两种：Rho因子依赖型和非Rho因子依赖型(也称为固有终止子)。此外，根据是否在两个转录方向上具有终止作用又可分为单向终止子和双向终止子。在原核生物中[17]，Rho因子依赖的终止子一般需要Rho蛋白和ATP来进行辅助，才可使RNA聚合酶从新生模板链上掉落；原核生物体内大多含固有终止子，并且许多固有终止子并不是直接位于终止密码子之后，且终止子长度一般小于50 bp。固有终止子的结构特点是：富含GC的茎环和位于3'端的U-tract。在转录时，内在终止子依靠特殊的回文序列形成发卡结构，在终止子3'端的poly-U处形成7–9 nt的DNA: RNA杂合物，使转录聚合物解聚、RNA聚合酶掉落进而停止转录[8]。

天然终止子在转化到合成生物技术实际设计过程中，需要根据基因线路的调控需求来选择合适的终止子。Chen等和Du等[18-19]研究发现，不同强度的启动子需要匹配不同强度的终止子，为了避免对下游基因转录造成影响，强启动子需要强终止子进行转录终止。在体内需要使用转录终止子隔绝不同转录单元之间的干扰，但大量重复终止子的使用致使DNA序列间发生重组，进而导致遗传不稳定，影响异源基因表达。为了解决这一问题，MacPherso等[20]使用随机序列构建具有不同序列的人工终止子，以避免重复序列，同时这些人工从头设计的序列具有不同终止效率。这种设计策略由于需要构建容量超大的基因文库，并需要大量的筛选，对高通量筛选技术有严格的需求，并且需要大量且烦琐的重复性工作。而结果往往是筛选过程中绝大多数的序列都是无效序列。这一问题促使研究者采用另外一种更加理性的设计方法，根据已有的天然序列信息，借助再设计的手段来获取功效更强的终止子元件。

基于此，本文挑选了10个具有不同ΔG的B. subtilis来源的终止子和5个噬菌体来源的终止子在B. subtitles 168菌株中进行终止效率的测定，得到了不同终止效率的终止子。然后将不同终止子进行不同拷贝数的串联，发现弱-弱、弱-强终止子的串联可以进一步提高上游基因的表达量和抑制下游基因的表达，三串联终止子几乎完全抑制下游基因的表达。将高终止效率的串联终止子用于外源重组蛋白的表达，可提高外源蛋白的表达量。

本研究所用菌株和质粒见表 1。

PrimeTHARⓇ Max DNA聚合酶、Dpn Ⅰ DNA消化酶，DNA marker购自TaKaRa (北京)公司；2×GenRec重组试剂盒购自通用生物系统(安徽)有限公司；BamHⅠ、SacⅡ、Xho Ⅰ、Sac Ⅰ限制性内切酶和T4 DNA ligase购于New England Biology公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；PCR仪、蛋白电泳仪购自Bio-Rad公司；分光光度计购自上海美谱达仪器有限公司；多功能酶标仪购自BioTeck公司。

本实验对编码红色荧光蛋白mCherry的基因进行密码子优化，并使用RBS calculator在线设计网站(https://salislab.net/software/)为其匹配合适的RBS。用引物mCherry-1/mCherry-2扩增mCherry基因；以P1/P2为引物，pBP43GFP为模板扩增质粒骨架。PCR扩增产物用DpnⅠ DNA消化酶消化2 h，再对PCR产物进行纯化，最后使用Gibson assembly将mcherry线性片段和pBP43GFP骨架片段融合、环化，然后转化E. coli JM109并挑取单菌落进行测序验证，重组质粒pBP43-GFP-mCherry (GM)保存至–20 ℃备用。

单终止子检测平台构建。单终止子检测质粒基因结构如图 1所示。终止子单链寡核糖酸由金唯智生物科技有限公司合成，末端包含BamH Ⅰ和Sac Ⅱ酶切后粘末端的序列，如表 2。将其按体积比为1:1的量加入PCR管中，以温度梯度退火的方式连接终止子，程序设置如下：98 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，接下来从90 ℃开始，每隔30 s，温度依次降低2 ℃，直至40 ℃，然后4 ℃保温。

用BamHⅠ和Sac Ⅱ酶切质粒GM，纯化后使用T4 DNA ligase连接终止子和线性化GM载体骨架，16 ℃过夜连接。连接产物转化E. coli JM109，LB琼脂平板过夜培养后挑取单菌落，LB液体培养后提取质粒，DNA测序验证。然后使用Spizizen法转化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168[21]，构建出含有单终止子检测功能的重组菌。

双串联终止子平台的构建。检测质粒中基因结构如图 2所示。将gfp基因下游顺序串联的2个终止子所在位置定义为A和B。设定B位终止子为TB5或TB10，A位使用前述选择的不同单终止子(TH1.5a，TH1.5b，TB2，TB5，TB6，TB7，TB10)与B位串联。合成末端含有BamHⅠ和Sac Ⅱ酶切后粘末端序列的双终止子寡核苷酸，两元件之间的间隔区加入XhoⅠ和SacⅠ酶切位点，如表 2中的A-TB5-1/2和A-TB10-1/2。双终止子两条单链寡核苷酸退火同前述程序。退火后与用BamHⅠ和SacⅡ限制性内切酶对质粒GM酶切连接，方法同前述单终止子构建。

三串联终止子检测平台的构建，基因结构如图 3所示。合成末端包含XhoⅠ和SacⅠ酶切后粘末端序列的终止子寡核苷酸序列，见表 2。退火后与XhoⅠ和SacⅠ酶切后的双终止子重组质粒连接，其余步骤同单终止子构建方式。

本研究使用终止效率(termination efficiency，TE)表征终止子元件的转录终止效能[22]。将完全破坏转录复合物的终止子的TE值定义为100%；将两个报告基因之间无终止子时的转录通读定义为1。采用下游mCherry(FIDW)与上游GFP(FIUP)的荧光比值来估计终止子通读率(terminational rate，TR)，即TR=FIDW/FIUP。当上下游报告基因之间无终止子，以此为参考通读值(TRREF)，然后将所有TR测量值标准化：TRNORM=TR/TRREF，用以下方程计算终止效率，TE=100×(1–TRNORM)。

含不同类型终止子的B. subtilis 168重组在LB平板上划线，于37 ℃过夜培养。挑取单菌落于含有卡那霉素的5 mL试管中，培养12 h。测定样品的OD600，按照初始接种量(OD600=0.05)接种到含有50 mL LB培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃、200 r/min培养24 h，之后吸取1 mL菌液，12000 r/min离心2 min，收集菌体，PBS缓冲液洗涤3次，再用等体积PBS重悬菌体，取200 µL至96孔板，检测OD600和荧光强度。参数设置：吸收光600 nm，检测菌体浓度；激发光495 nm，发射光525 nm，增益60，检测GFP荧光强度；激发光587 nm，发射光610 nm，增益80，检测mCherry荧光强度。

以pBglpD-gusA为模板，使用引物gusA-i-F/R扩增β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase，GusA)基因，以pBP43GFP为模板，使用引物gusA-v-F/R扩增GusA骨架；以pBP43EcAspA为模板，使用引物AspA-i-F/R扩增大肠杆菌天冬氨酸氨基裂解酶(L-aspartate amino lyase，AspA)基因，使用引物AspA-i-F/R扩增AspA骨架。PCR扩增产物用DpnⅠ DNA消化酶消化2 h，再将PCR产物纯化，然后将对应的骨架与片段进行Gibson组装，最后转化E. coli JM109并挑取单菌落进行测序验证。构建成功的各重组质粒转化B. subtilis 168后，构建出重组菌，–80 ℃保存备用。不含终止子的质粒pBP43-gusA-0、pBP43-AspA-0转化B. subtilis168后作为对照组。将串联终止子用于重组蛋白表达的质粒构建：以pBP43-gusA-0、pBP43-AspA-0为模板，以TB10-TB5-F/R和TH1.5b-TB5-F/R为引物进行反向PCR扩增，构建出质粒P43-AspA-TH1.5b-TB5、P43-AspA-TB10-TB5、P43-gusA-TH1.5b-TB5、P43-gusA-TB10-TB5，最后把重组质粒转化B. subtilis 168并保存。

取出保藏的甘油菌划线至LB固体平板，37 ℃过夜培养后，挑取单菌落至试管，37 ℃培养8–10 h。按照初始细胞密度OD600=0.05接种到含50 mL LB培养基的250 mL锥形瓶中，37 ℃、200 r/min培养24 h。将培养基中的培养液取出1 mL，12000 r/min离心2 min，收集菌体，用1× PBS缓冲液清洗3次，再加入含有1 mg/mL溶菌酶的TE缓冲液悬浮，于37 ℃温浴2 h。超声破碎，工作时长3 s，间歇时间2 s，直至菌悬液澄清透明。12000 r/min离心20 min，取200 µL上清，然后加入50 µL的5× loading buffer，沸水浴10 min，上样检测。

本研究根据现有B. subtilis终止子组学数据的挖掘[23]，对425个内源终止子的自由能ΔG值分布进行统计，结果见图 4。ΔG值从–31.9 kcal/mol到–2.5 kcal/mol之间分布较宽泛，本实验随机选取了10个具有不同ΔG的终止子，为了与B. subtilis内源终止子比较，同时又选取了5个B. subtilis噬菌体SPO1来源的终止子[24]。

将以上终止子序列构建到终止子检测平台GM上，转化B. subtilis 168后，挑取单菌落至试管，37 ℃培养8–10 h。按照初始OD600=0.05接种到250 mL锥形瓶中，37 ℃、200 r/min培养24 h，检测GFP和mCherry的荧光水平，并计算终止效率(TE)。结果如图 5所示，相比于参照组，插入不同终止子后，终止子上游GFP的荧光强度有不同程度的提升(1.1–2.2倍)，并下调下游mCherry荧光强度(1.3–28.4倍)，表明插入的终止子发挥了转录终止功能，对下游的mCherry转录产生了较强的抑制作用。其中，与参照相比，TB5终止子将上游GFP的表达水平(10896±24.04)上调了2.2倍，将下游mCherry表达(1784.04±86.18)水平下调了28.4倍，表现出较强的终止作用。

基于上述结果，计算15种终止子的TE值，并系统比较终止效率。结果如图 6所示，TB4、TB5、TB9和TH1为强终止子(TE > 95%)，其中TB5终止效率为99%；TB1、TB7、TB10、TH1和TH1.5b为弱终止子(TE < 5%)。TB3终止效率为负值，表明这一元件不具有终止转录的作用，推测为RNA元件。通过上述研究，鉴定得到了终止效率较高的终止子。

已有研究表明，转录调控元件间的重复或组合能够发挥更强的生物功能，如人工复合启动子[25]。在此，为探究终止子间的组合对转录终止效率的影响和作用规律，我们将2种终止子串联融合设计成双串联终止子，如图 2所示，选取终止效率适中的TB10 (TE=43%)和终止效率最高的TB5 (TE=99%)作为双串联终止子中的B位终止子，分别在其上游位置A位融合不同强度的终止子，形成两组不同强度终止子的双串联组合，构建到终止子检测质粒中测定双串联终止子的作用效率。结果如图 7所示，TB10终止子双串联组合中，TB10-TB10、TB7-TB10、TB6-TB10串联体与A位单终止子相比，上游GFP荧光强度有一定程度的上调，且进一步下调了下游mCherry的荧光强度。当不同强度的终止子与TB5强终止子串联后，上游GFP荧光强度与A位单终止子相比，双串联终止子显著上调GFP的表达水平，同时对下游mCherry具有显著下调效应。其中，终止子串联体TH1.5b-TB5对GFP荧光水平的上调幅度最大(2.3倍)，TB5-TB5串联体对mCherry表达水平的下调幅度最高(30.5倍)。终止子串联之后，与高终止效率的单终止子相比，比如TB5，串联终止子对上游GFP的上调水平和下游mCherry的下调水平无显著影响，推测这可能受限于启动子自身的转录水平。

最后，通过计算得出双串联终止子的终止效率。结果如图 8，与A位单终止子相比，TB10-TB10和TB7-TB10的终止效率分别提高了1.6倍和1.2倍；TH1.5b-TB5、TB10-TB5、TB7-TB5的终止效率分别提高了2.7倍、2.3倍和2倍。这一结果说明，弱终止子通过基因串联可以提高终止子的终止效率；弱与强终止子串联，可提升整体终止效率。结果中TB5-TB5的终止效率较TB5无显著提升主要原因是受限于目前终止子效率采用的检测方法。通过双荧光蛋白表达量的相对值来表示终止子强度难以在高转录终止效率区间分辨这种差异，故在检测强-强串联的终止效率方面受到一定限制。

为了确证是否多个单终止子的串联能够持续提升终止效率，本研究接下来构建了3个终止子融合的串联体，分析增加终止子的串联融合数量影响终止效率的规律。选取终止效率相对较低的TB6-TB10、TB6-TB5和终止效率最高的TB5-TB10、TB2-TB5双串联终止子为模板，分别与强终止子TB5和弱终止子TH1.5b进行再次串联，构建具有不同组合的三串联终止子。将含有三串联组合终止子的重组菌在250 mL锥形瓶中培养24 h后，检测GFP和mCherry的荧光强度。结果如图 9所示，TB6-TB10在与TH1.5b组合三串联后，GFP和mCherry的荧光强度与相应的双串联终止子相比没有显著变化，表明3个弱终止子串联后不能显著提升终止子的性能。TB5-TB10、TB6-TB5和TB2-TB5双串联终止子在与TB5进一步组合后，对mCherry产生了明显的抑制效应，这一结果表明这种类型的串联组合方式可以对下游基因产生极高水平的转录抑制作用。

终止效率如图 10所示，与TB5-TB10、TB2-TB5串联的终止子，TE值虽高于90%，但与双串联终止子相比，没有显著提升，提示TE大于90%的极强终止子再次提升效率的空间受限。低终止效率的双串联组合体TB6-TB10、TB6-TB5与强终止子TB5再次串联，可提升终止效率(TE > 90%)。其中，TH1.5b与不同双串联终止子进行串联时，发现并不能提高TE值，初步确定弱终止子进行三串联对提升终止效率有较大限制。

上述结果表明，通过构建三串联的串联终止子，在B. subtilis中对这些终止子进行表征，获得了具有不同终止效率的新型终止子，同时这些终止子对上游GFP的提高和下游mCherry的抑制都有明显区别。这些新型终止子丰富了枯草芽孢杆菌中的终止子库，扩大了可供选择的范围。

为检验串联终止子的可靠性和适用性，将本研究构建的终止子用于不同种类的外源基因表达，检验强化不同基因表达的效能。为了充分保证转录终止和稳定mRNA，强终止子选用高TE的双串联终止子TH1.5b-TB5和TB10-TB5。外源基因选用大肠杆菌天冬氨酸氨基裂解酶(AspA)和β-葡萄糖苷酸酶(GusA)两种酶进行终止子功能验证。构建出含P43-AspA-0、P43-AspA-TH1.5b-TB5、P43-AspA-TB10-TB5、P43-GusA-0、P43-GusA- TH1.5b-TB5、P43-GusA-TB10-TB5质粒的B. subtilis 168重组菌株。将保存的菌液划线得到单菌落，转接5 mL试管，然后转接250 mL锥形瓶培养24 h，收集菌液，裂解细胞后进行SDS-PAGE分析。结果如图 11所示，与不含终止子的对照相比，插入终止子后，AspA和GusA蛋白的表达水平均有明显提升。同时发现，同一终止子对于两种蛋白水平的提升幅度有差异。与GusA蛋白表达水平相比，两种串联终止子对于AspA的表达水平提升更显著。相同终止效率的不同终止子对蛋白的表达有不同的影响，终止子TH1.5b-TB5对于外源蛋白表达水平的提升略低于终止子TB10-TB5。

近些年来，许多学者对终止子作了许多研究工作：一方面是终止子的机理研究，比如通过改变终止子两端序列来调节终止子终止效率[26]，探究RNA聚合酶与转录终止的关系，建模预测终止子的终止效率[22]；另一方面是将终止子应用于外源基因表达，比如通过使用3个T7终止子串联的方式提高目的产物产量[27]，添加终止子提高不同转录单元的稳定性[28]。

本研究发现，强终止子可以提高上游基因的表达水平。不同终止效率的终止子对上游基因表达水平的提升不同，总体而言，终止效率越高，对上游基因表达水平的上调程度越显著，表明强终止子可以通过稳定mRNA、延长半衰期来提高上游基因的表达水平，终止效率越高，其稳定性越高。与这一结果类似，在真核细胞中[29]，也可以利用终止子延长mRNA半衰期和提升mRNA稳定性，进而提升表达量。本研究所提出的策略能够从天然终止子中快速构建性能更强的终止子的新策略。当可用的天然终止子元件稀少，性能不够强时，可通过此策略快速提升天然终止子的作用性能。如文中TH1.5b-TB5和TB10-TB5终止效率为97%，终止效率较TH1.5b和TB10提高了2.5倍。而当串联终止子的数目达到3个时，位于终止子下游的基因基本不表达，可完全抑制转录通读。

本研究显示枯草芽孢杆菌的内源终止子终止效率要高于这一菌种的噬菌体终止子。分析这部分高终止效率的终止子序列结构，发现低吉布斯自由能且茎部无凸起的终止子具有较高的终止效率。目前使用的多为天然终止子，序列中不仅含有终止功能序列，同时还具有调控序列的功能[30]。直接用于构建基因表达调控系统，尤其是用于人工设计的多线程基因电路的表达调控时，作用稳定性较差，易受所在基因环境的影响。本研究同样发现在调节不同基因表达时，相同终止效率的终止子上调GFP的水平有差异，说明其兼容性和模块化程度易受到基因环境的影响。

终止子的从头设计近年被认为是解决这一问题的新思路。由于人工从头设计的终止子不含有无关调控序列，理论上不会参与到细菌内源基因表达的调控网络中，因此具备较强的正交性。在大肠杆菌中，已经建立了天然终止子和合成终止子的模型(R2=0.81)，通过现有序列去预测该终止子序列的终止效率[31]。在本研究的基础上，接下来可以进一步扩大天然终止子的鉴定范围，进而探明二者的作用规律，建立序列和功能之间相关性的模型，用来反向指导人工终止子的理性设计。