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ChIP-seq的核心是检峰(Peak Calling),当然现成的工具有很多,其中MACS比较常用,本文以MACS v2为例进行检峰的原理和使用。 一、背景染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)也称结合位点分析法,是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。 多种组学手段 二、实验 ChIP实验模式图 一、软件下载著名代码托管网站github上有最新的开发版本: https://github.com/taoliu/MACS 二、软件使用(1)双峰模型 检峰过程MACS2是基于模型(泊松分布)的方法进行检峰的,上述示意图中的模型是双峰模型,目的是为了将比对上的Reads朝3`端偏移(shift),以更准确地得到蛋白-DNA互作的位置。 这里需要注意对于单端数据(SE)需要进行shift以评估平均插入片段大小(Insert Size);若使用的数据为双端(PE)则直接使用真实的Fragment Size进行检峰。 (2)检峰 单链双峰模型2.1 建立shift模型: MACS2以固定大小窗口扫描基因组;取前1000个富集程度最好的峰;区分正/负链比对reads,评估d的长度;建立正/负链模型。 2.2 检测显著峰 Reads向中心Shift 1/2d的距离;以长度2d的窗口扫描全基因组得到显著富集的候选峰(基于泊松分布); 合并重叠的峰。 # d:插入片段长度 三、峰型(1) 窄峰 -转录因子等 专转录因子(2) 混合峰 - 聚合酶II等 聚合酶II(3)宽峰 -组蛋白等 组蛋白 四、如何使用MACS2非常适合转录因子和组蛋白修饰类型的检峰。 使用MACS2时需要根据不同峰型进行参数的调整,软件说明文档参数如下: 常用参数:macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test -q 0.01 宽峰参数:macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam --broad -g hs --broad -cutoff1 其中,-t为ChIP样本;-c为control样本即input;-f为输入文件的格式,一般使用BWA、Bowtie2比对后的BAM文件;-g有效基因组大小,MACS2内置了一些物种如人类是hs;-n为样本名称;-q为检峰显著性阈值; --broad为检测宽峰的阈值; -cutoff为筛选fold-enrichment的阈值。 针对转录因子类型为了得到结合位置的峰顶可以添加 --call-summits,另外--extsize具体数值可以使用macs2 predictd进行评估(例如评估值为200),检峰参数如下: macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test --call-summits --nomodel --extsize 200 -q 0.01 针对组蛋白类型,需要合并邻近的峰形成宽峰,检峰参数如下: macs2 callpeak -t ChIP.bam -c Control.bam -f BAM -g hs -n test --broad --nomodel --extsize 173 -cutoff 2 -q 0.01 对于双端数据,-f参数为BAMPE,这时检峰所使用的插入片段长度为实际的平均插入片段长度,不需要建模(使用--nomodel,同时--extsize失效) 检峰之后就是检测基序(motif)了,链接:检测基序 五、其他软件参考如下文章: 检峰软件比较 检峰精确性比较(NRSF基序) 六、参 考[1] https://www.encodeproject.org/ [2] https://en.wikipedia.org/wiki/ChIP-sequencing [3] https://www.illumina.com/techniques/sequencing/dna-sequencing/chip-seq.html |
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