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​耐药基因是编码耐药性状的一段核苷酸序列（DNA片段）。与其他遗传物质一样，耐药基因在细菌分裂增殖过程中得到复制。耐药基因可位于细菌的染色体上，也可位于染色体外的质粒上，质粒携带的耐药基因可通过接合、转化、转导等方式在同种细菌甚至不同种细菌的菌株之间传播。

抗生素的大量使用，导致细菌通过获得基因或染色体突变，使之能够耐受这些药物，从而产生细菌耐药性，使得多种传染病可能没有可行的抗生素治疗，对人类健康造成巨大的风险。细菌耐药性已成为威胁全球公共卫生健康的重要因素之一。2017年世界卫生组织(World Health Organization，WHO) 发布对人类健康最具威胁的12种“超级细菌”，表明细菌抗生素耐药性已成为全球公共卫生问题。

根据我国2014至2019年及2022上半年的细菌耐药性监测报告( http://www.chinets.com)显示，耐药性大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌为我国临床主要耐药菌。

基于细菌的耐药基因检测技术，目前已有商业化产品应用到了临床，如Unyvero在对呼吸道常见病原体鉴定的同时纳入10种耐药基因为临床用药提供指导，有助于提高呼吸机相关性肺炎（ICU VAP）与医院获得相关性肺炎（HAP）患者的早期精准诊断并减少广谱抗生素的使用；Xpert Carba-R Assay碳青霉烯耐药基因检测试剂为感控监测提供解决方案，可以1 h内对急诊患者进行产碳青霉烯酶的细菌进行筛查并指导感控举措；最新升级的Filmarray的血培养鉴定panel包含了11种常见的耐药基因，比第一版血培养鉴定panel检测更多的细菌与耐药基因，甚至也拓展至VAP患者肺泡灌洗液检测。但因临床患者不同病程背景的多元化体现及随时变化的病情，商业化产品可能无法满足临床医生的实际需求，因此这就要求临床实验室提供新的解决方案以应对临床的实际需求。

细菌的耐药性检测、新型细菌耐药性检测技术的开发和应用迫在眉睫。临床上多 重耐药细菌的检测中，抗生素敏感性试验( antimicrobial susceptibility testing，AST) 是目前较常使用的方法，包括纸片扩散法、琼脂稀释法、肉汤稀释法、浓度梯度法等经典方法。随后出现了物理、化学和分子生物学检测技术，如应用流式细胞仪、质谱仪和拉曼光谱仪等方法推算细菌的耐药性；以及免疫杂交技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术等检测细菌的耐药基因。如今，随着测序技术的迭代更新和生物信息学的发展，高通量测序技术已经广泛应用于细菌耐药检测领域，包括全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)、宏基因组测序(metagenomics sequencing，mNGS)和微生物单细胞转录组测序(microbial-single-cell RNA sequencing，MscRNA-seq)等技术。

​WGS是指获得一个物种全基因序列的过程。在细菌耐药性检测领域，WGS 可以提供细菌全面的耐药基因谱，并通过耐药基因预测其耐药表型，揭示相关耐药机制。多项研究对WGS和表型AST检测细菌耐药性进行对比，结果呈高度一致性，证明了通过WGS预测细菌耐药性的准确性。此外，通过WGS鉴定耐药细菌基因组中染色体和质粒编码的抗生素耐药基因，有助于了解耐药基因的移 动和传播背后的机制，还可以对耐药菌株的爆发流行进行监控。但是此类技术检测周期较长，价格较贵，且样本需要纯细菌培养物，对临床细菌的鉴定分离要求较高。

02、基于宏基因组的第二代高通量测序mNGS

mNGS是通过高通量测序技术检测特定环境样品中微生物群体的基因组信息。通过生物信息学分析方法进行病原体鉴定、微生物组分析、宿主相互作用分析和细菌耐药性预测。在临床细菌耐药基因检测中，mNGS能诊断未知病原体的感染，并挖掘其耐药基因，为临床合理使用抗生素提供参考。基于mNGS技术，Wang等在1例免疫功能低下的重症肺炎患者的培养阴性肺组织样本中鉴定出肺炎克雷伯菌，并进一步鉴定出blaSHV-12、blaKPC-2、blaTEM-1、blaCTX-M-65等抗性基因。此外，mNGS还可用于新型耐药基因的检测。Torres-Cortés等通过 mNGS技术，从土壤样本中确定了11种新的抗生素耐药基因，包括新型氨苄西林耐药基因、庆大霉素耐药基因、氯霉素耐药基因和甲氧苄啶耐药基因等。mNGS 的优点在于直接从原始样本进行无偏检测，在对现有耐药基因筛查的基础上挖掘新型耐药基因。但是该技术成本高，步骤复杂，缺乏标准化和自动化的分析流程，对细菌耐药基因的大规模筛查较为困难。

03、MscRNA-seq

单细胞转录组测序( single-cell RNA sequencing，scRNA-seq) 是指对单个细胞的转录组进行测序，从而获得转录组学信息，揭示细胞群差异和细胞进化关系。MscRNA-seq是近年最新的检测技术，其原理是将scRNA-seq应用于单个微生物，如细菌细胞的转录组测序中。但是MscRNA-seq的发展受限于微生物mRNA含量低、部分细菌独特的细胞壁和细胞膜以及mRNA无多聚腺苷酸化等原因，技术壁垒高，发展较为困难。美国华盛顿大学Georg Seelig研究团队利用基于分割池连接的转录组测序( split-poolligation-based transcriptome sequencing，SPLiT-seq) 技术对细菌进行了微生物单细胞转录组microSPLiT测序( microbial split-pool ligation transcriptomics) ，首次通过低成本、高通量的方法成功进行细菌单细胞的转录组测序分析工作。microSPLiT通过组合条形码标记RNA的细菌细胞来源，一次实验可分析数以万计的细菌细胞。随着科学技术的发展，MscRNA-seq技术克服了mRNA含量低、细胞多样性和细胞壁结构复杂等困难，通过此类技术挖掘临床超级细菌中耐药基因的转录组，理解耐药基因的表达、转移等问题，对进一步检测和筛查临床多重耐药性具有重要的应用价值。

总结

传统细菌耐药性检测方法能提供细菌耐药的表型信息，但需要长时间的培养和鉴定，且无法检测耐药基因。以物理、化学和分子生物学方法为基础的新技术，其细菌耐药性检测周期短、灵敏度高，但是无法检测未知耐药基因及突变基因。而基于高通量测序的检测技术对经典方法的表型检测进行补充，可以准确鉴定细菌的耐药基因，发现新的耐药基因及突变位点。在未来细菌耐药性的表型和基因型的综合检测，对于控制耐药细菌感染及流行至关重要，也为相关感染性疾病的预防和监测提供新的技术支持。

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