【陈巍学基因

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分两个部分进行介绍：

1.介绍外显子测序的技术方法

2.介绍外显子测序可以得到哪些有用的生物信息

外显子测序的核心技术是针对人外显子序列设计的捕获探针库，这些探针的序列，都和人外显子的DNA序列相互补。在实验过程中，它可和人的外显子DNA序列进行杂交结合。同时，这些探针都标上了生物素。有了这个捕获试剂盒，就可以进行建库和捕获了。

杂交过程中，通过核酸序列的互补结合的原理，探针会和目标DNA片段进行结合。再用结合了链霉亲和素的磁珠，与这个杂交混合液呐进行混合。

因为链霉亲合素会和生物素牢固结合。这样，就把我们要捕获的外显子目标片段，通过探针，间接地结合到了磁珠上。然后，通过磁铁把这些磁珠给吸附下来。

而把上清液呐给去掉，也就把没有结合的DNA片段给洗掉了。接下来，用洗脱液，把我们要的DNA文库从磁珠上给洗脱下来。那么这些文库呐，再经过PCR扩增，就可以上HiSeq测序仪进行测序了。测完序以后，就可以进行生物信息学的处理了。

先是把这些测序的DNA片段比对到人的基因组上，再把这些比对到基因组的序列进行突变分析。

一般用Agilent SureSelect 50M的试剂盒进行外显子建库、捕获。再用HiSeq 2500 V4 PE125的方法进行测序，测10个G的数据量。大约可以得到95X的“有效测序深度”。我们说的有效测序深度（effective sequencing depth）是相对于总测序深度来说的。

总的测序深度呐，是把所有测得的数据（量）去除以目标区域的大小。举例来说，用Agilent 50M的这个试剂盒，我们测到10个G的数据。去除以目标区域的50M的大小，那么得到的是200X的测序深度（10G/50M = 200X）。但是这个200X的测序深度，对于做生物信息学分析来说呐，并没有太大的实在意义。因为当中还要扣掉许多无用的数据，才能得到有效的数据。 在外显子测序中，要扣掉4种因素引起的无效数据。

这个落在目标区的数据，占全部被测到的数据的比例，我们用一个专业术语来称乎它，叫作捕获效率(capture efficiency)。那么AgilentSureSelect这个试剂盒呐，它的捕获效率，大约是65~70%。

然后，我们会比较这2个序列的数据质量，留下那个数据质量比较高的，去掉那个数据质量比较低的，这也就是我们通常所说的“去Duplication"的过程。用Agilent SureSelect试剂盒进行建库、捕获，实测10个G的数据，我们发现duplication大约在5%左右。duplication的比例不是恒定不变的。而是会随着测序深度的增加、而增加，因为上机（测序）的文库是经过PCR扩增的文库。随着测序量增大，那么测到源自同一个模板的PCR子分子的概率呐，就会提高。

那这个70BP的交叠的序列，是冗余的序列。也就是说，我们读了250个BP的序列，但是其中大约有效的呢，是180个（BP）。有70个BP呐，是冗余的。

综合上述4项因素，我们可以看到，用AgilentSureSelect 50M的这个捕获试剂盒进行建库、捕获，并且用HiSeq V4 PE125的测序方法来测序，测10个G的数据量，那么可以得到，大约95X的有效测序深度，（10 * 0.7 * 0.95 * 180 / 250 / 50 = 95）。

除了测到的有效数据量之外，还有一个因素会影响到后面的分析，这就是Reads的分布均匀情况，也就是说目标区域的每个碱基被覆盖的深度的均匀性。那么这个结果呐，是越均匀越好。

科学家经过实测，发现Agilent的SureSelect、和Roche的Nimblegen，这两个捕获试剂盒，所得到的覆盖均匀性是比较好的。

外显子测序，可以测Germline突变（胚胎形成时就带有的突变），也可以测体细胞突变（Somatic Mutation），但随着Illumina推出HiSeq X10测序仪，把人全基因组测序的直接成本降到1000美元以下，那么Germline水平的突变呐，已经很少用外显子来测了。目前，外显子测序的主要优势就体现在肿瘤基因测序方面，之所以外显子测序在肿瘤基因测序方面有优势是因为外显子测序，它的测序深度，可以比较容易地做到“深度”测序。它可以比较轻易地达到100X、200X，甚至更深的测序深度。这就有利于测到 low allele frequency （低等位基因频名优新）的体细胞突变。因为肿瘤中的突变呐，往往都是 low allele frequency 的体细胞突变。所以，外显子组测序就在测肿瘤基因组突变方面，显出比较明显的优势来。

那么如果是要测肿瘤中的体细胞突变呐，一般是拿手术切下来的肿瘤组织DNA、和病人外周血中的白细胞基因组DNA，进行外显子测序。一般肿瘤的测100~200X的深度，白细胞的（DNA）测100X的深度。从白细胞DNA得到这个病人的Germline基因组序列，拿肿瘤的DNA序列与之做对比，找出其中的体细胞突变。

外显子组测序，主要能够得到的信息是点突变，也就是SNP信息，和插入缺失突变，也就是Indel信息。这张图就是找到的体细胞突变的泡泡图。在这个泡泡图中，突变频率越高的基因，就画一个大泡泡，放在图的中间。突变频率低一点的基因，就画一个相对小一点的泡泡，延着逆时针排列。再低频的突变，再画一个再小的泡泡，再在外面再排列下去。依此类推，就得到这样一个泡泡图。

泡泡图有利于我们非常直观地看到样本中体细胞突变的情况。

找到突变之后，就可以进一步地做GO和Pathway分析。这张图是GO分析的结果。

这是根据突变的点在肿瘤中的富集的情况做的分析。分成“细胞组件”、“分子功能”、和“生物过程”3个大类，进行展示。柱子越高，则表示这个亚类当中突变越多。

这是有向无环图，它把突变进一步一步富集到更精细的小概念当中进行展示。

这个图中，是越向下，它的功能就划分得越精细。同时颜色越深的块块，则表示突变在这个小概念中富集程度越高。

这是Pathway的KEGG富集分析。它吶，可以帮助我们看到哪些通路发生了显著的变化。

更深一步的分解分析，则让我们深入地看到突变的基因在整个通路中所处的节点。

让我们更好地探索突变和病变之间的关系，我们要说明：在外显子测序的数据分析当中，对基因组的结构变异是不敏感的。不敏感的原因是外显子测序，只测了基因组上很小一部分区域，这个比例小到了只有1~2%，所以当结构变异的断点，不落在外显子区域的时侯呐，外显子测序是看不到这些断点的，所以我们说：外显子测序对基因组的结构，变异--SV（Structure Variation）呐，是不敏感的。

外显子测序对拷贝数变异（CNV，copy numbervariation），不是很敏感。不敏感的原因呐，是因为杂交捕获过程啊，是一个含了很高偶然性的过程。也就是说，一个外显子片段上，它有多少个reads(序列)被捕获下来，样本和样本之间是有很大差异的。或者说，它的覆盖度，本来就是忽高忽低的，因为有这种忽高忽低呐。这就导致：一个外显子上测到的Reads数变高，或者变低。我们很难判断，是因为这种偶然性呐，还是因为拷贝数发生了变异。所以，外显子测序，对于小片段的拷贝数变异，它本身是不敏感的。但是，如果基因组上发生了大片段的拷贝数变异。比如说，长度在5M(5M base pair)以上的片段发生了拷贝数变异。那么外显子测序是可以发现的，这是因为这样长的片段当中呐，一般含有多个外显子。当多个外显子的测序Reads数都发生了改变，那么，它就会有统计上的显著性。通过这种统计上的显著性，我们可以来判断：基因组上的确发生了拷贝数变异。

因为外显子组测序对结构变异和拷贝数变异不敏感，所以，在实际的肿瘤基因测序中呐，科学家往往是这样做的：用全基因测序来找到肿瘤样本中的结构，变异（SV）和拷贝数变异（CNV），再用来外显子组测序来找肿瘤样本中的、低频的SNP和Indel体细胞突变。

参考:https://www.cnblogs.com/think-and-do/p/6613719.html