RMD水稻突变体信息及基因型鉴定

2024-06-29 08:14| 来源: 网络整理| 查看: 265

材料与试剂

2 ml离心管 PCR管各种型号吸头 (20 μl, 200 μl, 1 ml) 75%乙醇 Primers 载体左端测序引物：NTLB5 5’>AATCCAGATCCCCCGAAT TATGCAGGTTCTCTCCA AATSequence1|Possible location: Chromosome 3 (by Zhang Jian) CGTCCGCAATGTACTCACCCGGCCTAGCATACGACCTGCTGCCTGTCTTGAGAACGCCACGAAGCGGCAGCCTGCATGTCGTTTACGAGGAGCCCTTAGATTCCCCTCCAGAATTAGGAGTACACGCCCTGTGTTGGTGTCGATCAATCGATAATGTAGATTGATCGCAATCGAGATGGGTGTTGATGAGCAGGATCATATCCATCCTCCTCTTGGGGGTTTCTCTGCAGGCTCCTGACAGACAATGAATGTGTGCACATGATCAATGCAGATGCGTGCAGCTATCGAAATCTTGGTTGGTACTTGTCCTGGATGGCTTGATTAGATTGTTAATACCAAAACACATTTTTTCGCTCATACTGATATACGAGTAGTAGTAGGACTTCCTCGTGAGCTCTCTTGAATTCATCTCACTCGACGA 2) 用该侧翼序列在NCBI上做BLAST，由BLAST结果可知以下信息 (如图6)： T-DNA插入为点为第三染色体5013391处，该家系strand=Plus/Plus，分离侧翼序列的引物为NTLB5 (TTL _03Z11AA66 _NTLB5) 将b和c结果对应表应得知T-DNA是反向插入在基因组中。

图6. 03Z11AA66侧翼序列NCBI Blast结果展示 3) 在插入位点(5013391)处，取前后1Kb的序列如下 (加粗为引物潜在区)： 1 agcccaaccc gaccctgccc cgcctcgttg ccatccctag ctgcaacctc gggtgcccca 61 ccagcgagca tgggcaattc cgtctcatca cccggtattc caacgaaaaa gatttcaaaa 121 atgcacaaaa cgatcgaaat ggcaaagtga ctgtgagtac gcgcttcata ttgacatttt 181 aacgaagcgt gtttttgaga tggcattcca atgatactgt tttttaaacc tggtcaaatg 241 tccattttct agttcgggac ttcccagtcc tagccatgta gcctgagagc tgagatacac 301 accccagcag tatcctgtgc aaggcatgat cgagtcgaat ccgtccctgc caatggcaca 361 agtcttttca agggggtgtt tagcccctct cccccccccc ccccccctag ctagctggta 421 gtggctggcg ctacgcatgc acaggcacgt cgcttcgccc gctgcgtgca tcatatgcat 481 ccatccatct ggtctcctgt tttatggacg gacgggtcgc tgcacgggcg gtctgcacgc 541 tgtcacgcgc agcctggcat acgggcttgt catatgtcaa agatgcagac acacacgaca 601 caagagccag ttggggttgg gaggttgcgc gtagcctctt tcccacacgt gaccccctcc 661 ctactctccc cactgccgcc acaacttacc aggatccatg cgagaatcgc accaaaaacg 721 ccaccaatct cgtgaactcc accacctcca tcgtatcgcc cggcctttcc actagctagc 781 agcctagcac acagctgatc gatcggcgaa gctagtcacg ccacggcgat gcgattatcc 841 cggtgtcgtt tacgcggcgg ccgctagggt gtcggatggg ctatgtcgtc gtcgttgcca 901 ctgcttgtgt gtgtaccaaa tcgggtgcgt tgtttcgact gttggtcgat gcgagtacct 961 accgcatgtg atggacgggc ctgcaggcga cttgtcgatg gcaacgtact cacccggcct 1021 agcatacgac ctgctgcctg tctcgtgaac gccacgaagc ggcagcctgc atgtcgttta 1081 cgaggagccc ttagattccc ctccagaatt aggagtacac gccctgtgtt ggtgtcgatc 1141 aatcgataat gtagattgat cgcaatcgag atgggtgttg atgagcagga tcatatccat 1201 cctcctcttg ggggtttctc tgcaggctcc tgacagacaa tgaatgtgtg cacatgatca 1261 atgcagatgc gtgcagctat cgaaatcttg gttggtactt gtcctggatg gcttgattag 1321 attgttaata ccaaaacaca ttttttcgct catactgata tacgagtagt agtaggactt 1381 cctcgtgagc tctcttgaat tcatgtgtgt cggagcggca gcgtcacacg ctgcgcccct 1441 acgcattttt aggatctcag agcagtcatc agtcttcgtg tacctcagta ctttgaattc 1501 tctttgcctg tagcagatgc tttttttttt tgacatgaat agcagatgca ttcactgtgc 1561 attcccttcc cccttctctc gatcgacgcg acttacccgt atactgcatc actgcaaact 1621 cacataaatt tacccgtgac cgtgtgcccg tgtgatcatc ctccaatcaa actgtccttc 1681 ccttttcacc ttaaaaggac cggccggaac gcttctctca tcttccagtc gtactattac 1741 agtccagtcg ccgcaatgga tggctggcat gtcaaagatg atgaattggt gatggtggca 1801 cccggttgca cttgcgcccg cggctggcaa cgcggcatca cagatctcac acgcgcggac 1861 taaaaaccga cgtgacaaca cggccgcggc caacgacgag accggccggt atgggagctt 1921 gccgctgcat gcgacgtcga cgttgatgtg gccaagacac ggagcgttac gtatagtgcg 1981 ctcgtacgca ggcgcgcatg c 针对这段序列设计两条引物 (下图中AS，S，图7)，产物大小在800至1200bp之间 (建议在1Kb左右)，插入位点在产物中间位置 (距离产物两端400-600bp均可)。

图7. 03Z11AA66 T-DAN在基因组上插入位置方向示意图对于03Z11AA66家系而言，则应该选择引物组合为：S+AS/AS+NTLB5或者S+AS/S+PFRB4，由于我们分离出的是左端序列，您一般用NTLB5来验证杂合、纯合，即选用组合S+AS/AS+NTLB5。当然也可以选择S+AS/S+PFRB4组合，特别是第一个组合扩增不出来的时候。 4) 使用引物检测基因型(条带位置根据你的引物而定) (图8)

图8. 引物检测基因型电泳示意图 (W：野生型，H：杂和型，M：纯和型) 3.5 对于Tos17反转录转座子的突变体，检测原理与T-DNA插入突变体基因型检测原理步骤是一致的，引物选择如下表3：表3. Tos17反转录转座子突变体检测引物组合

参考文献

陈秋红，陈太钰. (2018). 农杆菌介导粳稻遗传转化. Bio-101 e1010174. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010174. (in press) 李燕，龙湍, 吴昌银. (2018). 组培水稻种子发芽. Bio-101 e1010183. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010183. 凌飞，吴昊. (2018). 水稻DNA小样抽提. Bio-101 e1010101. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010101. (in press) 吴昌银. (2003)．水稻T-DNA插入突变体库及其Enhancer trap系的创建．[博士学位论文]．武汉：华中农业大学图书馆. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. and Kumashiro, T. (1994). Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J 6(2): 271-282.

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