乳腺癌BRCA1/2基因大片段重排的研究进展

乳腺癌是中国女性发病率最高的恶性肿瘤[1]，约5%~10%的乳腺癌与癌症易感基因的遗传突变相关[2-4]，其中最主要的乳腺癌易感基因为BRCA1（breast cancer susceptibility gene 1）与BRCA2（breast cancer susceptibility gene 2）。BRCA1位于17q21，包含22个编码外显子、2个非编码外显子，编码1 863个氨基酸。BRCA1蛋白调控细胞周期进程，参与DNA损伤导致的S期和G2/M期细胞周期阻滞的激活。BRCA2位于13q12，具有27个外显子，编码3 418个氨基酸。BRCA2蛋白主要调控RAD51丝状体的形成和活性，参与同源重组途径中DNA损伤修复[5]。据乳腺癌信息中心（breast cancer information core, BIC）报道，已检出的BRCA1/2致病性基因突变达1 600多种，这些突变分布于整个编码区，绝大多数为单个或数个碱基改变引起的移码突变、无义突变，这些突变类型会导致截短蛋白形成，影响BRCA1/2蛋白质功能。携带BRCA1/2胚系突变的女性，其乳腺癌终身患病风险显著增高，携带BRCA1胚系突变的女性70岁时患乳腺癌的风险为47%~66%，携带BRCA2胚系突变的女性携带者相应风险为40%~57%[6]。中国家族性乳腺癌中BRCA1/2突变频率为10.5%[7]，高加索人种家族性乳腺癌中BRCA1/2突变频率为15%~20%[8]。然而，有研究发现，在高风险乳腺癌和（或）卵巢癌家族中，普通测序所检测到BRCA1/2突变频率低于连锁分析的预测频率，仅63%的BRCA1连锁家族能够检测出BRCA1致病性基因突变[9]，这一结果表明，Sanger测序等常用的突变筛查方法不足以发现BRCA1所有基因胚系缺陷类型，如大片段重排。

1997年，Puget等首次报道了BRCA1的大片段重排——E17缺失，缺失片段长约1 kb碱基[10]。随着检测方法的改进，越来越多的BRCA1/2大片段重排被发现，现已知超过120种BRCA1大片段重排和40种BRCA2大片段重排。大片段重排指数百至数百万个碱基片段的重复或缺失，常累及一个或多个外显子[11]。重排类型大部分为基因片段的缺失，也存在二倍重复、三倍重复或复杂型缺失插入[12]。这些改变往往引起读码框移，导致突变的肽链结构与功能的异常。

人类基因组中约有1百万个散在的含有限制性内切酶位点的Alu重复序列，可介导染色体重排和同源重组，如基因片段的插入、缺失、重复、易位[13-14]。有研究发现，一种BRCA1 del E5-7突变是由于intron4 AluSx序列与intron7 AluSc序列存在相同的15bp碱基序列，此处发生非等位基因同源重组，导致中间长约5kb碱基片段的缺失[15]。另一项研究发现，BRCA1 del E3-5突变是由于intron2 AluY序列与intron5 AluJb序列存在相同的16 bp碱基序列，发生非等位基因同源重组后，中间长约14.6 kb碱基片段的缺失[16]。

此外，BRCA1假基因ψBRCA1位于BRCA1与相邻NBR2基因的上游，与BRCA1具有较高同源性，可与之发生非等位基因间的同源重组。ψBCRA1引起BRCA1大片段重排最常见的类型为BRCA1基因上游碱基片段及BRCA1 E1、E2的缺失。Preisler等发现一种BRCA1 delE1-2，位于BRCA1 intron2的nt 34118位置，因ψBRCA1 intron2与BRCA1 intron2具有188个相同的碱基序列，两者之间发生同源重组，导致中间长达36.9 kb片段的缺失，包含BRCA1的E1与E2、NBR2全基因、部分ψBRCA1[15]。此外，Puget等鉴定出两种不同的BRCA1 delE1-2断裂位点，分别位于BRCA1 intron2的nt34439与nt34339位置[17]，这也证明了BRCA1基因5’端存在重组热点。

另有研究者认为BRCA1基因大片段缺失可能由短串联重复序列介导的非等位非同源的交叉重组引起[15]，此外，在DNA复制过程中，短串联重复序列可能导致滑脱错配，引起不同长度片段的缺失[18]。

人们探索过多种基因重排的检测方法：早期Southern Blotting技术被用来检测基因片段的拷贝数变化，但由于费力、耗时、消耗DNA量大、可能出现假阳性结果等原因，现已不常用[19-20]；长片段PCR（long range PCR）被用来鉴定特定类型的大片段的基因突变，包括基因内的缺失、插入、重复与染色体断裂等，适用于已知重排类型的断裂位点鉴定，但不能提供基因总体的重排概况，不能检测到易位或是倒置[21-22]；实时荧光定量PCR（real-time PCR）可同时扩增和定量目的DNA片段，但通量低，不适用于筛查整个基因[23]；双色荧光原位杂交（dual-color FISH）可以检测染色体内的插入、缺失、扩增、倒置和染色易位，仅适用于检测大片段的染色体异常[20, 22]；短荧光片段多重定量PCR（quantitative multiplex PCR of short fluorescent fragments, QMPSF）是一种检测基因片段缺失和重复的灵敏方法，已有研究采用这种方法检测BRCA1大片段重排[24-25]，然而此方法对实验条件要求高，而且需要实验员具有丰富的经验；比较基因组杂交技术（comparative genomic hybridization, CGH）是检测DNA拷贝数的分子细胞遗传学方法，是检测整个基因重排情况的有效方法[25]，但并不能检测出拷贝数正常的染色体突变类型。

多重链接依赖探针扩增技术（multiplex ligation-dependent drobe amplification, MLPA）是应用最广泛的检测基因DNA序列拷贝数异常的方法，是检测BRCA1/2大片段重排最常用的方法[26-29]。其基本原理是通过DNA变性、探针与样本DNA杂交、杂交探针的连接、连接探针的PCR扩增、PCR产物的毛细管电泳，进行实验样本自身标化及与正常对照样本相比较，根据产物峰值来评价是否存在基因的重复或缺失[30]。MLPA是一种廉价、敏感、可靠、高通量、操作简单、DNA用量少的基因重排检测方法[27, 31]。然而，当探针结合位点的DNA序列发生多态性改变时，探针与目的片段的结合力会受到影响，可能导致假阳性结果的出现，因此，该检测方法需要使用异位探针试剂盒进行验证[32]。

BRCA1/2基因大片段重排在不同地区人群中的发生频率为0.2%~12.2%，占BRCA1/2全部致病性基因突变的0.9%~21.4%[12, 21, 26, 28, 33-36]。美国一项研究纳入了300个遗传性乳腺癌和（或）卵巢癌家族，这些家族中患乳腺癌或卵巢癌的家族成员 > 4人且BRCA1/2普通测序未检出突变，在35个（12%）家族检出了BRCA1/2基因大片段重排[33]。而美国另一项研究纳入了2万余例乳腺癌患病高风险人群和2万余例普通人群，在高风险人群中BRCA1/2大片段重排的检出频率为2.4%，占所有BRCA1/2致病性基因突变的9.9%，普通人群的检出频率为0.5%，占所有BRCA1/2致病性基因突变的5.9%[12]。德国一项研究发现乳腺癌高风险人群中BRCA1大片段重排频率为2.1%（32/1506），BRCA2大片段重排频率为0.2%（1/412）[28]。捷克的172个遗传性乳腺癌和（或）卵巢癌家族中检出10个（5.8%）家族携带BRCA1大片段重排，未检测BRCA2大片段重排[21]。西班牙的207个测序阴性的乳腺癌高风险家族中检出1个（0.5%）家族携带BRCA1大片段重排，另1个（0.5%）家族携带BRCA2大片段重排[35]。南美洲智利的74例测序阴性的乳腺癌高风险患者中发现3例（4.1%）BRCA1大片段重排，未发现BRCA2大片段重排[26]。巴西的210个遗传性乳腺癌和（或）卵巢癌家族共发现2个（1.0%）家族携带BRCA1大片段重排，未发现BRCA2大片段重排[37]。非洲尼日利亚的352例测序阴性的非筛选乳腺癌患者中只发现1例（0.3%）BRCA1大片段重排，未检测BRCA2大片段重排[38]。阿尔及利亚的40例早发性乳腺癌患者中检出1例（2.5%）BRCA1大片段重排及1例（2.5%）BRCA2大片段重排[39]。

另有研究发现，起源于拉丁美洲/加勒比海地区高风险人群BRCA1/2大片段重排频率较高，为6.7%[12]，而存在BRCA1/2始祖点突变的德系犹太人罕见BRCA1/2重排[40]。

在亚洲地区，韩国一项研究对306例BRCA1/2普通测序阴性的乳腺癌患者进行了大片段重排的检测，检出3例（1%）患者携带BRCA1大片段重排，未检出BRCA2大片段重排[41]；韩国另一项研究纳入106例高风险乳腺癌患者，检出2例（1.9%）患者携带BRCA1大片段重排，未检出BRCA2大片段重排[42]。巴基斯坦一项研究在120例早发性乳腺癌及家族性乳腺癌患者中检测出4例（3.3%）患者携带BRCA1大片段重排，未检出BRCA2大片段重排。马来西亚一项纳入524例早发性或家族性乳腺癌患者的研究中检测出7例（1.3%）BRCA1大片段重排和2例（0.4%）BRCA2大片段重排，其中BRCA1 del E1-14与BRCA2 del E22-24携带者为华裔[43]。新加坡94例早发性或家族性乳腺癌患者中有1例（1.1%）华裔携带BRCA1 dup E13[44]。香港Kwong等在1 236例高风险乳腺癌和（或）卵巢癌患者中共发现5例（0.4%）BRCA1大片段重排（del E1-12、del E17-20、del E1-8、del E5-7、del E20-22）与3例（0.2%）BRCA2大片段重排（del E21、del E15-16、del E25-27[29]），并证实BRCA2 del E15-16为中国人群的始祖突变[45]。

遗传自同一祖先的胚系突变称为始祖突变，由于存在始祖效应，始祖突变在特定人群中发生频率较高。现已有多种BRCA1/2大片段重排被证明为始祖突变。1997年Petrij等第一次报道了荷兰人群中存在始祖突变——BRCA1 E22缺失，此种重排突变在荷兰遗传咨询人群中频率高达12.2%[34]。此外，美国有研究者在746例西班牙裔非筛选乳腺癌或卵巢癌患者中检测出BRCA1/2大片段重排21例（2.8%），其中13例（1.7%）为始祖重排BRCA1 delE9-12，占BRCA1重排数目的62%（13/21）[46]。BRCA1 delE9-12始祖重排在早发性三阴性乳腺癌患者中发生频率较高，为9.5%（18/190）[47]。此外，葡萄牙裔存在BRCA2 c.156_157insAlu导致E3缺失始祖突变，此种重排在家族性乳腺癌患者中发生频率为6.7%（14/208）[48]。

多个地区的BRCA1发生重排的频率高于BRCA2[29, 43]，美国一研究中BRCA1大片段重排频率约为BRCA2的10倍[12]。这是由于BRCA1基因内含子中Alu重复序列比例（42%）明显高于BRCA2基因（20%）[49]，可为非等位基因间的同源重组提供更多热点[28, 38, 50]。然而，在男性乳腺癌家族中BRCA2重排频率相对较高，澳大利亚一项对于乳腺癌高风险家族的研究中，BRCA2重排频率为2%（3/149），接近BRCA1大片段重排频率2.2%（6/271），且发生BRCA2重排的3个家族均有男性乳腺癌家族史[51]。在另一项芬兰的研究中，39个男性乳腺癌家族中，3个（7.7%）家族检出BRCA2重排[52]。此外，一项关于葡萄牙裔BRCA2始祖突变c.156_157insAlu的研究发现，携带此突变的家族中男性乳腺癌发病比例显著高于非携带家族（23% vs. 12%）[36]。

此外，有研究认为BRCA1/2大片段重排与以下因素正相关：患两次乳腺癌，首次乳腺癌患病年龄小，ER、PR阳性，病理类型为浸润性导管癌（IDC）伴导管原位癌（DCIS），Myriad预测评分较高，一级亲属中患乳腺癌的人数较多[53]。

多项涉及不同人群的研究表明，BRCA1/2大片段重排在遗传性乳腺癌家族中占有重要比例，对于高风险人群，在普通基因突变检测阴性的情况下，建议进行大片段重排的检测。尤其对于具有始祖效应的大片段重排，在特定人群中的检测是必要的。目前，有关我国内陆地区人群BRCA1/2大片段重排的数据尚少，携带该基因突变患者的临床病理特征、对不同治疗方案的敏感度以及是否存在有效的预防措施等方面也有待进一步研究。伴随着基因检测的普及，人们对于肿瘤遗传的关注程度及咨询需求日益增加，MLPA是一种廉价、敏感、可靠的基因重排检测方法，利用该技术开展BRCA1/2大片段重排的检测，可避免对BRCA1/2基因突变携带者的漏诊，有助于为携带者提供更积极的防治措施，减轻社会负担，提升社会效益。