犬孕酮酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒及其制备方法【掌桥专利】

技术领域

本发明属于动物医疗器械体外诊断领域，涉及一种犬孕酮检测试剂盒，具体涉及一种犬孕酮酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒。

背景技术

犬孕酮是由黄体分泌的一种甾体激素。在雌性犬生殖活动，如排卵、维持妊娠、启动分娩、乳腺发育等各方面发挥着重要的作用。临床检测犬孕酮可确定犬最佳配种期，通过监测孕酮值的下降，可确定分娩时间，也可确定妊娠期是否需要补充孕酮，提高受胎率，对提高犬繁殖能力和水平有重大意义，对犬生产养殖单位帮助巨大。

犬孕酮在发情不同阶段，含量呈现规律性，临床检测方法有仪器法：化学发光仪器、液相色谱质谱联用仪和高效色谱等，这些仪器成本高，操作复杂，对检测人员及环境有较高的要求，需要配套试剂使用。还有基于免疫层析法检测，制备的胶体金检测试纸条能快速检测出结果，但是该方法的敏感性不足，且不能准确定量分析。制备的量子点检测试纸条敏感性高，能快速的检测出结果，但是检测通量低，每次只能检测一只，对于大型养殖单位成本较高。

酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA)：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。本发明基于酶联免疫吸附实验的基本原理创新出一种高通量，高灵敏度，低成本的犬孕酮检测试剂盒，应用在大型犬生产繁殖单位，使得孕酮的检测快捷、准确和高效，从而指导生产实践。

酶联免疫吸附过程中，常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶 (AP)，相应的底物分别是邻苯二胺(OPD)和对硝基苯磷酸盐，前者呈色反应为棕黄色，后者为蓝色。可用目测定性，也可用酶标仪测定光密度(OD)值以反映抗原含量。

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是临床检验试剂中的常用酶，比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同工酶组成，分子量为40,000，等电点为pH3～ 9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和 58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm 和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(最高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多，此外，辣根过氧化物酶(HRP)标记物(酶标抗体、抗原、多肽等) 在低浓度下不稳定，极易失活，因此，现有技术通常通过添加HRP酶标稳定剂，从而实现在极低浓度水平下的室温保存长度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、准确，低成本的检测犬孕酮的试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种犬孕酮酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒。包括预包被微孔板、样品稀释液、酶标二抗、显色试剂、洗液、标准品和终止试剂；

所述预包被微孔板的制备方法为：采用NUNC板孔内4℃过夜包被犬孕酮抗原，吸去抗原后，加5％的牛奶封闭30分钟，弃去，扣干后室温真空过夜干燥即得；

所述样品稀释液为牛奶；

所述酶标二抗为HRP酶标犬孕酮抗体；

所述显色试剂为ABTS(KPL)；

所述洗液为0.01MPBS缓冲液，标准品孕酮含量0.1ug；

所述终止试剂为NaF溶液。

优选地，所述酶标二抗的制备方法为：1mg HRP溶于40ul 0.25mol/l的PBS 中，加入25％戊二醛10ul，37度孵育2h后加入遇冷的无水乙醇0.2ml，2500rpm 离心15min，弃去上清，沉淀用1ml 0.05M碳酸盐缓冲液，加入2mg/ml犬孕酮抗体，混匀后冰箱过夜，加入KH

优选地，酶标二抗中添加酶标稳定剂；

优选地，所述样品稀释液为5％的牛奶，优选地，含0.01％Procline200；

优选地，所述终止试剂为1.25％的NaF溶液。

本发明还涉及一种采用酶联免疫吸附检测试剂盒快速、准确，低成本的检测犬孕酮的方法：

(1)将犬血清或者血浆用PBS稀释后加入微孔板内；

(2)预先对标准品分6个梯度稀释；

(3)标准品加入微孔板反应；

(4)反应物洗涤3次、扣干；

(5)加入酶标二抗1ug/ul，100ul/孔反应；

(6)加入显色试剂显色；

(7)2min内酶标仪读数，波长405nm和492nm，所得结果以OD＝△405- △492，做标准曲线，计算样本孕酮含量。

优选地，所述稀释倍数为50倍；

优选地，所述微孔板添加量为100ul/孔；

优选地，步骤(2)的稀释梯度为0ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml 和0.625ng/ml；

优选地，所述步骤(3)的反应条件为20-37℃，优选37℃，反应时间为 20-40min，优选为30min；

优选地，所述步骤(5)的反应条件为20-37℃，优选37℃，反应时间为 20-40min，优选为30min；

优选地，所述显色试剂为ABTS(KPL)；

优选地，所述显色条件为室温，10-40min，优选30min；

任选地，步骤(6)后加入终止试剂100uL/孔，15min内读数计算，并做标准曲线，计算样本孕酮含量。

本发明的技术优点在于检测犬孕酮快速、准确，低成本，对临床检测有重要意义，可推广性高，市场应用前景广阔，整个检测过程在1.5h内完成，通过酶标仪读数，简单处理数据，可知犬血液中的孕酮含量。本发明检测通量高，在样本数量多的情况下比免疫层析试纸条检测效率更高，检测所需要的仪器也简单，整个实验只需要酶标仪、孵育器即可完成检测，有较强的经济效益，特别适合犬生产繁育单位使用，成本低，检测实惠，可大量推广，借助酶标仪读取数据，通过提供的数据处理软件，简单操作即可完成孕酮含量准确测定，从而对生产繁育提出建议，适合养殖单位基层人员使用。

本发明所采用的抗原板，更有利于检测，质量更稳定，批间差异性小，敏感性更高，适合长期保存，采用的酶标二抗，更有利于检测敏感性和特异性，和量子点标记免疫层析试纸条一致，抗体更有利于保存，采用的标准试剂有利于稳定检测敏感性，确认检出率，保证实验结果的稳定有效。

附图说明

图1 ：96孔板酶联免疫反应过程；

图2：酶联免疫吸附标准曲线。

具体实施方式

现在将描述本发明的优选实施例。还应理解,提供实施方案是出于说明的目的,而不限制本发明的范围。

实施例1预包被微孔板、样品稀释液、显色试剂、洗液、标准品、终止试剂的制备

微孔板的材质为高结合力NUNC板，(货号：400011-5)，将犬孕酮抗原 100ug/孔加入NUNC板内，4度过夜包被，吸去抗原后，加5％的牛奶封闭30 分钟，弃去，扣干后室温真空过夜干燥；铝箔袋加干燥剂抽真空密封保存。

样品稀释液：5％的牛奶，含0.01％Procline200。

显色试剂：ABTS(KPL)。

洗液：0.01MPBS缓冲液。

标准品：孕酮含量0.1ug抗体保护剂溶液(实验室制备，LOT:20200813)。

终止试剂：1.25％的NaF溶液。

实施例2酶标二抗的制备方法

酶标二抗：HRP酶标犬孕酮抗体(实验室制备：LOT:20201029),标记过程： 1mg HRP溶于40ul 0.25mol/l的PBS中，加入25％戊二醛10ul，37度孵育2h 后加入遇冷的无水乙醇0.2ml，2500rpm离心15min，弃去上清，沉淀用1ml 0.05M 碳酸盐缓冲液，加入2mg/ml犬孕酮抗体，混匀后冰箱过夜，加入KH

实施例3犬孕酮酶联免疫吸附检测方法一

(1)将犬血清或者血浆用PBS稀释50倍后加入微孔板内，100ul/孔，同时加入标准品，标准品稀释6个梯度，血清或血浆中的犬孕酮会与微孔板内的抗原特异性结合，37度孵育30min,然后洗涤3次，扣干；

(2)加入酶标二抗1ug/ul，100ul/孔反应，37度孵育30min,然后洗涤3次，扣干；

(3)加入ABTS，室温显色30min后用酶标仪读数，波长405nm和492nm， 2min内读数；

(4)所得结果样品OD＝△405-△492，做标准曲线，根据标准曲线和样品检测结果计算犬孕酮含量。

测定结构如表1所示：

表1犬孕酮酶联免疫吸附测定结果

试验结果表明，本发明采用的犬孕酮酶联免疫吸附检测试剂盒能够快速测量犬孕酮含量，每次实验最多可测90个样本，在1.5h内能够完成全部测试。多次试验结果表明，标准品检测所得标准曲线与试剂盒所提供的标准曲线相关系数均R>0.99，可见，本发明采用的犬孕酮酶联免疫吸附检测试剂盒能够稳定地测量犬孕酮含量，结果可信度高。

出于提高结果准确性考虑，上述每次检测必须做标准品梯度，且与提供的试剂盒提供的标曲相关系数R2>0.98。为了进一步验证本发明所采用的试剂盒检测方法所得结果的准确性，采用化学发光法和某市售商业试剂盒与本发明的试剂盒同时检测相同样本的犬孕酮含量，结果如表2所示：

表2三种不同方法检测犬孕酮结果比较

结果表明，本发明检测特异性与化学发光一致，准确度高于市面上的商业试剂盒。

实施例4犬孕酮酶联免疫吸附检测方法二

(1)将犬血清或者血浆用PBS稀释50倍后加入微孔板内，100ul/孔，同时加入标准品，标准品稀释6个梯度，血清或血浆中的犬孕酮会与微孔板内的抗原特异性结合，37度孵育30min,然后洗涤3次，扣干；

(2)加入酶标二抗1/100稀释100ul，37度孵育30min,然后洗涤3次，扣干；

(3)加入ABTS，室温显色30min后用酶标仪读数，波长405nm和492nm；

(4)加入终止试剂100ul/孔，15min内读数。

(5)所得结果样品OD＝△405-△492，做标准曲线，根据标准曲线和样品检测结果计算犬孕酮含量。

实施例5犬孕酮酶联免疫吸附检测方法三

(1)将犬血清或者血浆用PBS稀释50倍后加入微孔板内，100ul/孔，同时加入标准品，标准品稀释6个梯度，血清或血浆中的犬孕酮会与微孔板内的抗原特异性结合，37度孵育30min,然后洗涤3次，扣干；

(2)加入含酶标稳定剂的酶标二抗1ug/ul，100ul/孔反应，37度孵育30min，然后洗涤3次，扣干；

(3)加入ABTS，室温显色40min后用酶标仪读数，波长405nm和492nm， 2min内读数；

(4)所得结果样品OD＝△405-△492，做标准曲线，根据标准曲线和样品检测结果计算犬孕酮含量。