流式细胞仪使用

2、如何调整补偿：有以下原则

①多色实验（超过单色）时，所有荧光染料都要做一个单染孔

②先设置电压，再调整补偿，保证读取样本时的电压与调整补偿的电压一致，也就是说补偿调好之后，不要再改变电压。

③有些抗原表达弱，阳性群不明显，例如IFN-γ-PE，我们可以替换为CD3-PE或补偿微球替换。

具体操作方法：假如以调节FITC和PE之间的补偿为例，因为有2种荧光素偶联抗体，故要设置2个单染管，设置方法如下：

FITC单染管：未标记PE偶联抗体，但纵坐标PE通道却有FITC的荧光信号（图A），因此需要将PE中接收到的来源于FITC荧光素的信号扣除，就是设置PE-FITC补偿值。 图B所示的是正确调节PE-FITC补偿值后的散点图，此时PE通道基本接收不到来源于FITC荧光素的信号，而且FITC阳性的细胞群和阴性的细胞群处于同一垂直线上（要求就是横平竖直）。 图C所示的是过度调节PE-FITC补偿值的散点图，FITC阳性的细胞群通道信号明显低于阴性的细胞群。

PE单染管：未标记FITC偶联抗体，但横坐标FITC通道却有PE的荧光信号（图D），因此需要将FITC中接收到的来源于PE荧光素的信号扣除，就是设置FITC-PE补偿值。 图E所示的是正确调节FITC-PE补偿值后的散点图，此时FITC通道基本接收不到来源于PE荧光素的信号，而且PE阳性的细胞群和阴性的细胞群处于同一垂直线上（要求就是横平竖直）。 图C所示的是过度调节FITC-PE补偿值的散点图，FITC阳性的细胞群通道信号明显低于阴性的细胞群。

有时双色分析不能满足实验需求，需要进行多色分析，设置方法同双色分析一样，依次调整分析。一般相邻的荧光通道之间需要调节补偿，相隔的荧光通道之间因为各自接收的波长范围相差较大，一般不需要调节补偿，如FITC通道和PE-Cy5通道之间一般不需要调节补偿，因为FITC荧光素发射的荧光波长一般达不到PE-Cy5通道接收的荧光波长的范围；同理， PE-Cy5荧光素发射的荧光一般也不会被FITC通道接收。

3、关于补偿的计算，调节补偿时分析系统自动会得出结果的，公式如下：

4、补偿对结果的影响：不调补偿、补偿不足或补偿过度均会对分析结果产生一定的影响。

5、影响补偿的因素：

（1）电压：电压对补偿的影响不小，电压变补偿变，所以我们前面提到先调节FSC、SSC和荧光通道的电压，电压调好之后再调补偿。

（2）荧光素偶联抗体：目前荧光素种类很多，大致可以分为有机小分子染料、荧光蛋白、复合染料、大分子染料、量子点，优缺点见下图：

尽管荧光素种类多，但由于有些荧光素发射的荧光波长不是绝对的集中，会溢漏到其他通道，需要调节补偿，所以选择时需了解清楚常见的荧光溢漏：

405nm激光激发的染料：

488nm激光激发的染料：

637nm激光激发的染料：

（3）细胞：也是影响补偿大小的一个因素，尤其是当细胞的理化性质相差较大时，如淋巴细胞和肿瘤细胞之间、活细胞与固定后细胞之间，标记相同的荧光素偶联抗体，使用相同的通道时，各通道之间的补偿可能不同，所以当细胞理化性质差异较大时，最好重新调节新的样品细胞的补偿，确保获得准确的流式结果。

（二）多色流式如何配色

原则1：查看所用流式细胞仪的配制，包括激光器、光路设计以及滤光片等，确定有哪些染料可用。

原则2：抗原的表达与荧光遵循强弱搭配，即高表达的抗原选用弱荧光、低表达的抗原选用亮荧光。关于某种抗原的表达强弱可以从文献上进行查找，下表列举了一些抗原的表达情况及荧光染料的相对亮度：

原则3：荧光染料重叠最小化

（1）如果仪器条件允许，尽量采用多激光激发减少重叠

（2）同一细胞上的抗原尽量减小光谱重叠

原则4：尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本，因为自发荧光强度在波长较长时迅速降低，例如APC荧光素

常见染料搭配，仅供参考：

（三）流式分析中的死细胞问题

样品细胞中一般都含有一定量的死细胞，死细胞也可以产生非特异性荧光，而且死细胞产生的非特异性荧光要明显强于活细胞，有的甚至强于荧光素产生的荧光信号。流式分析的目标是活细胞，如果在流式分析时将死细胞当作活细胞来分析，也会严重影响流式分析结果，例如下图：

常见的区分细胞死活染料有:

（1）细胞膜非同透性细胞染料，通过受损的细胞膜，标记死细胞核酸，不能透过活细胞细胞膜，常见的有PI、7-AAD;

（2）可固定的死细胞染料，适用于胞内免疫分析标记，种类很多。返回搜狐，查看更多