流式细胞仪的光学元件

作为分析平台，流式细胞术依赖于激光对单个细胞的检测以及对产生荧光和散射光的信号收集。光学元件可处理仪器内的光照和光线收集。

注意：如果您不熟悉基本荧光概念或常使用的滤光片和激光光源，我们强烈建议您查看Molecular Probes荧光大讲堂 - 荧光基础知识。这将有助于您更好地理解本文讨论的内容。

光学系统的组件协同运作，将不同波长的激光照射到细胞上，收集发射光子形式的数据（即侧向和前向散射光以及激发态荧光团的发射光），并将这些光子转换成电信号（即光电流），导入电子系统。光学系统的元件包括激发光源、透镜和滤光片（用于收集和仪器内发射的光信号）以及用于产生光电流的检测系统。

细胞与激光发生相互作用的地方，称为激光检测点。在这里，细胞排成单列通过，而聚焦激发光穿过细胞流。

在流式细胞仪中，最常见的激发光源称为激光。激光具有一致性（具有同步、相同的波频率）、单色性（具有单一波长）和高能性，这些特点可确保照射到细胞的光是具有特定波长的均一光线。流式细胞仪通常包含一条或多条激光谱线，表1列出了现有仪器的常见激发光线。图1展示了遍及整个光谱的可用激光谱线。图1展示了遍及整个光谱的可用激光谱线。

图 1.紫外-可见光谱。使用紫外-可见光谱中具有离散波长的激光来激发荧光基团。

在选择实验用的荧光基团时，对激发光源的了解至关重要。了解您的流式细胞仪中这些光源的配置也很重要。主要有两种装置：平行激光装置和共线激光装置（图2）。平行装置中的激光器在空间上是分离的，细胞通过检测点时，一次暴露于一个激发光源（参见图3示意图）。共线激光装置的激光器共用同一条光路，细胞同时被多个激光器激发（参见图4示意图）。

应注意，这些装置不是相互排斥的，因为一个仪器可以同时具有平行和共线激光装置。

图 2：平行和共线激光装置的对比。（左图）在共线装置中，多个激光器共用同一条光路，经过检测点的细胞同时被多个激光器激发。（右图）在平行装置中，激光器不共用光路，它们在不同的时间分别激发经过检测点的细胞。

图 3.平行激光装置示例。将488 nm（蓝色）和633 nm（红色）激光束放置在检测点中的不同位置，细胞将在不同时间分别经过两个激光器。在该装置中，每个激光器具有独立的光路，包括不同的发射滤光片和检测器。

图 4.共线激光装置示例。在共线装置中，两个激光器位于相同位置，两个激光器的光束同时激发细胞。两个激光器共用同一条光路，包括相同的发射滤光片和检测器。

这两种装置的最佳荧光基团选择是不同的，因此，在开始计划您的实验之前，您应该先了解您的仪器设置。例如，在图3所示的平行激光装置中，两种激光器在不同时间激发同一个细胞，每种激光器具有独立的检测器，您可以考虑使用发射波长相同但激发波长不同的两种荧光基团。有一种这样的组合是藻红蛋白-Alexa Fluor 647（PE-AF647）和别藻蓝蛋白（APC）（图5）。PE-AF647的激发波长是488nm，APC的激发波长是633nm。两种染料的发射波长均在680nm。PE-AF647偶联染料只能被488nm激光器激发，发射光可被专用于激光谱线的检测器收集。在相同细胞上，APC染料只有在第一个染料激发后才能被633 nm激光器激发，并且发射光将被其指定检测器收集。由于两个检测器在空间上是分离的，所以无需考虑发射重叠的问题。然而，如果您正在使用图4所示的共线激光装置，则两种染料将在相同位置被488和633nm激光器同时激发，而两种染料在相同波长处的发射光将不可区分。

图 5.PE-AF647和APC的激发和发射光谱。（A）图为PE-AF647（红色虚线）和APC（橙色虚线）的激发光谱。图中还标示了488 nm（蓝色垂直实线）和633 nm（橙色垂直实线）的激发光。（B）PE-AF647（橙色曲线）和APC（红色曲线）的发射光谱重叠。

在平行激光装置中，系统内存在时间延迟。该延迟是指细胞从一个激光器移动到继电器中的下一个激光器所需的时间（见图2，右图），系统可将细胞在检测点中被所有激光器激发之后收集的信号一起传输给电子系统。

虽然大多数仪器通常会自动设置时间延迟，但如果需要，也可以手动监控和调整。如果该时间延迟设置不正确，您可能会观察到信号丢失，或者是来自两个不同细胞的重叠信号。正确和错误延时设置的结果如下图所示（图6）。该实例中使用的荧光颗粒具有等量的两种不同荧光团，一种在488nm激发并发出绿色荧光，另一种在561nm激发并发出红色荧光。由于两种荧光基团在同一个颗粒上，所以您会预计它们的事件数相等，并且预计在时间延长设置适当的情况下，它们能够以相似的模式发射。图6A展示了这类实验的数据。在图6B中，数据刚开始看起来与图6A相似，但是操作者在30时间点时调整了时间延迟设置，并在50时间点再次调整。请注意，下游激光器的荧光（即继电器中第二个激光器）比触发激光器（继电器中第一个激光器）的荧光更低，并且事件的扩散范围更广。如果使用具有平行激光设置的仪器，您应记住这一点。

图 6.识别平行激光装置的延时问题。在两个实例中，颗粒均在具有平行激光装置的仪器中相继在488nm和561nm处被激发。（A）适当设置时间延迟，两种激光器的荧光强度和荧光事件扩散将非常相似。（B）在本实验中，刚开始的时间延迟设置时正确的，但在运行期间被调整。可以看出，与触发激光器相比，下游激光器的荧光事件强度和扩散发生了变化。这表示延时设置错误。

用于引导光路（光子）的发射滤光片和分色镜有许多种。图7对此进行了总结。每组滤光片可将特定波长的光引导至与其相匹配的检测器（详见下节）。分色镜也有助于将光线引导至检测器。

仪器中的滤光片、分色镜和检测器需要手动匹配至您选择的荧光团，因此，在设计实验和分析结果时，您需要先了解您的设置。按照惯例，流式细胞仪用户将使用“检测器”一词代表发射滤光片、分色镜和检测器本身这三种组件的组合。他们紧密结合在一起，必须相互匹配才能正常运转。

图 7.发射滤光镜实例。（A）这是一种长波通（LP）滤光片，所有特定波长以上的光均可通过。彩色线代表被偏转或允许通过滤光片的光波长。滤光片下方的图是通过滤光片的光与光波长的关系曲线。（B）这是一种短波通（SP）滤光片，只有低于特定波长的光才能通过滤光片。（C）这是一种带通滤光片，只有波长在一定上限和下限之间的光才能通过滤光片。

长波通（LP）滤光片允许特定波长以上的所有光通过。图7A的实例是LP 500滤光片，表示波长在500nm以上的所有光均可通过滤光片。请注意，紫外和紫色波长会偏转，而蓝色、绿色和黄色光线可以通过。

短波通（SP）滤光片允许低于特定波长的所有光通过。图7B的实例是SP 500滤光片，表示只有波长低于500nm的光可以通过滤光片。紫外线、紫色和蓝色光可以通过，而波长较高的绿色和黄色光被偏转。

带通（BP）滤光片可被认为是LP和SP滤光片的交叉组合。 只有特定波长范围内的光可以通过滤光片。图7C的实例是一个525/30 BP滤光片，表示只有波长在525 nm以下30nm内以及525nm以上30nm内的光可以通过滤光片，或者说是只有波长在495-555 nm范围之间的光可以通过滤光片。其他所有光将被偏转。

双色镜（也称为二色分光镜）是具有镜面涂层的LP和SP滤光片形式。除了可通过特定波长以上（LP）或特定波长以下（SP）的光之外，双色镜还可以将光反射到一定方向（图8）。例如，500LP双色镜可传输波长在500nm以上的光并将波长在500nm以下的光反射到其他方向。 525SP双色镜可传输波长在525 nm以下的所有光，并将波长在525nm以上的所有光反射到其他方向。这些双色镜对于检测器引导和捕获光线来说至关重要。

图 8.双色镜。该实例中的双色镜（或分光镜）分别与特定检测器相连。第一个双色镜(1)可反射红光并将其引导至红色检测器，同时允许低于红色光波长的所有光通过并传输到光路中下一个双色镜。第二个双色镜(2)可反射黄光并将其引导至第二个检测器，同时允许蓝光和绿光通过。最后一个双色镜 (3) 反射绿光并将其引导至第三个检测器，并允许蓝光通过。

检测器捕获由激发态荧光团和散射激光发射的光子，将它们转换成光电流（实际上，这只是用另一种说法表示由光子产生的电流），并传递到电子系统。流式细胞仪可使用多种类型的检测器，最常见的类型是光电二极管（PD）和光电倍增管（PMT）。传统上用于光纤通信的雪崩光电二极管（APD）已开始被一些流式细胞仪使用，它特别适用于检测长波发射（> 650 nm）。也有一些仪器使用电荷耦合器件（CCD）相机进行检测，但并不常见，本节不对此进行讨论。

当光子撞击PD时，它会将检测器的原子离子化，在PD的耗竭区域内产生电子/空穴对（图9A）。耗竭区域中的电子被扫向阴极上的正电位，空穴被扫向阳极上的负电位，从而产生光电流并传输至电子系统。PD价格便宜，但是灵敏度较低，它们对光电流的放大能力不如PMT。PD通常用于负责处理最明亮的光或信号的通道，如前散射通道。 

图9.流式细胞仪使用的检测器。(A)光电二极管检测器示意图。紫色圆圈表示光子与PD的正电位区域相互作用并生成电子（绿色圆圈）时所产生的空穴。这些电子/空穴对以紫色和绿色圆圈表示，它们之间通过红线连接。带负电的电子被吸引到带正电的阴极，而空穴被吸引到阳极。 (B)光电倍增管示意图。 当光子进入阴极的PMT时，被转换为电子。随后，电子通过PMT，在倍增极（电极） 中被放大，最终到达作为收集电极的阳极处。

PMT对于低信号水平更敏感，可以使单个光子的能量放大数百万倍。它们通常用于测量来自细胞的激发态荧光团的荧光以及侧向散射信号。当光子进入PMT时，它们撞击光电阴极并产生电子（图9B）。这些电子从倍增电极移动到产生二次电子的倍增电极，使信号放大。并非所有PMT和光子都是相同的。PMT对指定光波长的灵敏度高度依赖于PMT的材料。此外，远红外区的光子通常具有较少的能量，当它们进入PMT时，只有较少的光子会产生光电流输出。 

PMT的灵敏度也受到施加电压量的影响，需要根据具有指定配置的指定仪器上的PMT进行优化。 最常用的一种方法是“Peak 2”方法（Maecker和Trotter (2006)）。 这种方法采用一系列不同的电压设置运行昏暗的荧光颗粒（有时也称为电压滴定），并绘制信号扩散（或变异系数，CV）与电压量的关系曲线。应对所有您将使用的发射通道进行滴定，因为每个通道的最佳电压都可能会有所不同。

电压梯度实验实例如图10所示。我们只展示一个荧光通道（本例为荧光素标记颗粒的绿色通道）的数据，但如上所述，您需要对所有将在实验中检测的通道进行梯度试验。图10A为随着PMT电压设置的增加（范围为200mV至400mV），在一段时间内收集的荧光事件。您可以从数据中看到，在200 mV的最低电压下，荧光时间的扩散非常广泛（也就是说，低电压下的事件变化远远大于高电压下的事件变化）。同时，随着电压设置的增加，数据的变化逐渐变小，当到达一定高度时，相邻两个电压设置之间的数据看起来没有区别（350 mV与400 mV几乎无法区分）。如果绘制每个数据集相对于电压设置的CV百分比（%CV）（图10B）曲线，您将更清楚地看到这一结果。电压设置为200 mV时，%CV较大，但是当达到300-400 mV的范围时，%CV不会产生较大变化。最佳电压设置是指％CV或噪声最低并且具有最小CV值的最低电压设置。这被称为拐点。在本例中，您可以将绿色通道的PMT电压设置为350 mV，因为更高的电压不会再使CV值继续降低。

图 10.优化PM灵敏度。在一系列连续增加的PMT电压设置下，运行荧光素标记的颗粒。(A)在不同的PMT电压（图中标示了每个数据集的电压）下检测绿色通道中的荧光事件，并以时间为横坐标作图。(B)绘制图A中每个数据集的变异系数百分比（%CV）相对于PMT电压设置的关系曲线。在曲线上，%CV开始趋于平稳的点被称为拐点，由蓝色箭头表示，代表电压越高，数据变化越小。红色箭头是指该荧光通道的最佳PMT电压范围。  

流式细胞仪的光学元件可将荧光基团（与细胞结合）发射的光子引导至检测系统。这一过程是以高度可控的方式完成的，因此，您在收集数据时能够知道每个检测器接收到的特定光波长。检测器将散射光或荧光的信号光子转换成电流，电流大小与检测器撞击的光子数成正比。所得脉冲被传送到电子系统，经过数字化处理和记录以用于分析。