双特异性抗体构建在肿瘤临床治疗中的应用

双特异性抗体是能同时识别和结合两种不同抗原的抗体，因此可以发挥特殊的功能，例如将免疫细胞特异性与肿瘤细胞连接，增强其杀伤作用；同时结合肿瘤细胞上的两种抗原，阻断双重信号通路，降低肿瘤耐药性等，这些功能使得双特异性抗体相比于单抗而言灵敏度和特异性更高，具有更广阔的应用前景。抗体分子由抗原结合片段(Antigen-binding fragment，Fab) 和可结晶段(Crystallizable fragment，Fc) 组成，单克隆抗体只有一种抗原结合片段，因此只能结合一种抗原。1960年，Nisonoff等[1]将两个不同的抗原结合片段通过再氧化连接到一起，并证明了该产物可以募集两种不同类型的细胞，首次合成出双特异性抗体，开辟了抗体领域的新道路。双特异性抗体按照是否含有Fc段可以分为两类，含Fc段的双特异性抗体和不含Fc段的双特异性抗体，而每一大类中又可以细分成若干小类。随着抗体技术的飞速发展，科学家们已经制备出了大约100种不同类型的双特异性抗体[2-4]。双特异性抗体以其独特的性质和功能广泛应用于各种领域，包括穿透血脑屏障治疗神经性疾病[5]、SARS等传染性疾病的酶联检测[6]、体内医学成像[7]、肿瘤免疫治疗[8]等。

随着全球环境的恶化以及人们不规律的生活习惯，肿瘤的发病率越来越高，成为一种严重危害人类健康的疾病。2018年全球癌症统计数据显示，2018年全球癌症新发病例1 810万，死亡病例960万，其中亚洲新发病例占全球约50%，死亡病例约占70%，我国的癌症新发病例(380.4万) 和死亡病例(229.6万) 更是位居全球第一，情况不容乐观[9]。2018年全球新发病率最高的癌症依次为：肺癌(11.6%)、乳腺癌(11.6%)、结直肠癌(10.2%)、前列腺癌(7.1%)、胃癌(5.7%)；全球死亡率最高的癌症依次为：肺癌(18.4%)、结直肠癌(9.2%)、胃癌(8.2%)、乳腺癌(6.6%)。肿瘤的治疗手段包括手术切除、放化疗以及免疫治疗等。其中手术切除对肿瘤早期患者而言有较好的效果，但是一旦患者处于晚期，手术便不再是治疗的有效手段；放化疗在杀死癌细胞的同时也会侵袭正常细胞，导致副作用的出现。这些传统治疗方法往往不能根治肿瘤，还可能会导致肿瘤的复发和进展[10]。肿瘤免疫疗法是近几年新兴的治疗方法，通过激发免疫系统自身的能力来对抗肿瘤细胞，包括免疫检查点抑制、过继T细胞疗法等。但传统的单抗药物疗效往往有限，可能会引发肿瘤耐药性，且易发生脱靶效应[11]。此外，肿瘤的发病机制复杂，对多个靶点的同时阻断往往会有更好的治疗效果[12]，因此双特异性抗体应运而生。

双特异性抗体可以同时识别并结合两种不同抗原，灵敏度和特异性要高于单抗药物，减少了脱靶等副作用，有着更好的肿瘤治疗效果。近年来，不同结构的双特异性抗体不断被设计出来并商业化，且其中的一部分已经正在进行临床试验，用于多种肿瘤的治疗，包括非小细胞肺癌、胃癌、非霍奇金淋巴瘤、白血病等[13]。双特异性抗体介导的双靶向性有着很好的治疗前景，可以在时间或空间上将两种特异性的靶点连接在一起，但是真正应用到临床治疗仍具有一定的挑战。例如，全球首个双特异性抗体药物Catumaxomab，可以同时与肿瘤表皮黏附因子EpCAM和T细胞表面CD3分子特异性结合，Ⅱ/Ⅲ期临床试验(NCT00836654) 显示出了较好的治疗效果，258例出现恶性腹水的卵巢癌、胃肠癌、乳腺癌、胰腺癌患者，经Catumaxomab给药治疗后，无穿刺生存期对照组为11 d，实验组为46 d (P < 0.000 1)，显著延长了患者的生存期[14]。常见的不良事件是细胞因子释放相关的症状，包括发热、恶心和呕吐等，这些不良事件通常是低级或中级的，且可控可逆[15]，但在临床试验中，有受试者出现了急性肝衰竭并死亡[16]。此外，针对T细胞的双特异性抗体免疫治疗，会引起细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome，CRS)，炎性细胞因子如IL-6的血清浓度增加[17]，引起失控的全身炎症反应，严重的甚至危及生命。由此可见，双特异性抗体药物在肿瘤治疗方面仍需深入研究，以减少副作用，获得更佳的临床疗效。在这里，我们介绍了应用于几种常见肿瘤类型的一些双特异性抗体药物，并对其临床数据进行了汇总分析。

如图 1所示，双特异性抗体的研究可以追溯到1960年，Nisonoff等[1]将两个不同的抗原结合片段通过再氧化连接到一起，并证明了该产物可以募集两种不同类型的细胞，首次提出了双特异性抗体的概念。在此基础上，1983年，Milstein等第一次使用融合的两种杂交瘤细胞生产出不对称结构的双特异性抗体，并证明了该方法较化学合成法的优势，即避免了后者在处理抗体进行解链时引起蛋白变性导致的抗体失活[18]。不对称结构与天然抗体结构类似，具有最低的免疫原性，在临床治疗方面有着不可替代的优势。但在融合杂交瘤细胞的重链和轻链的随机配对中，产生了大量的非功能性抗体，使得双特异性抗体的产率极低，这一现象被称为链交联问题(Chain-association issue)[19]。1985年，Perez等第一次提出了可以特异性靶向T细胞表面受体T3和靶细胞表面抗原的双特异性抗体，研究表明，该抗体可以特异性连接效应细胞，使其杀伤第二抗原结合位点结合的靶细胞，增强抗体依赖的细胞毒作用。该研究使用的靶细胞包括鸡红细胞和异种肿瘤细胞，揭示了效应细胞的重定向可以用于肿瘤或其他表达特异性表面抗原的病原体的体内治疗[20]，为基于双特异性抗体的免疫治疗奠定了基础。1993年，不含Fc段的双特异性抗体，二价的抗体二聚体Diabodies首次出现[21]，Diabodies抗体分子小、组织穿透能力强，易于抵达病灶位置，在免疫治疗中有着重要的作用。1995年，Lindhofer等解决了链交联问题，他们发现大鼠和小鼠杂交瘤的融合，可以使轻链与重链配对的正确率增加，这一发现使得双特异性抗体的产率显著增加，提供了其大规模生产的可能性[22]。2009年，世界上第一个双特异性抗体药物Catumaxomab在欧盟获得批准，用于治疗EpCAM阳性的恶性腹水患者。2014年，Blinatumomab在美国获得批准，它是首个双特异性T细胞接合器(Bispecific T cell engager，BiTE) 结构的双特异性抗体药物，也是首个美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA) 批准的CD19双特异性抗体，用于前体B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗，并于2015年获得欧盟批准。2017年，Emicizumab在美国获得批准，成为血友病领域的首个双特异性抗体药物，用于存在Ⅷ因子抑制物的血友病的常规预防，并于2018年在欧盟获得批准。Emicizumab的获批预示着血友病的治疗不再局限于传统的凝血因子替代疗法，而是向免疫疗法和基因疗法迈进。目前双特异性抗体药物正处于发展阶段，多家生物医药公司都在进行双特异性抗体药物的研发，更高的投入和更成熟的技术将助力该行业进入黄金时期。

抗体可按功能分为可变区抗原结合片段Fab和尾部可结晶片段Fc。其中，可变区含有高变区段的氨基酸序列，它们三维结合在一起形成抗原结合表面，结合特定的目标抗原，由于这些氨基酸序列与抗原决定簇互补，所以又称为互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)；而Fc段可以与细胞膜上的Fc受体结合，从而介导各种生物学效应。如图 2A所示，标准的抗体有3个功能片段，两个抗原结合片段Fab和一个可结晶片段Fc，两个Fab片段与Fc通过铰链区相连，使得Fab段相对于Fc段有更大的构象灵活性[23]。

大多数天然的抗体是由相同的抗原结合位点组成的双价或多价的分子，左右对称，轻重链两两相同，两个抗原结合位点都针对于同一个目标抗原。唯独IgG4是个例外，它的铰链区域不稳定，使得其Fab段可以随机交换，产生具有两种不同抗原结合位点的二价抗体分子，是天然的双特异性抗体[24]。但具有明确特异性的双特异性抗体在自然界中并不存在，只能通过人工手段进行合成。因为抗原结合位点由轻链、重链的可变区构成，所以双特异性抗体的合成需要两个不同的轻链和两个不同的重链。随着双特异性抗体研究的深入与科学技术的发展，双特异性抗体在结构上出现了多种不同的设计策略，有着各自的优点与缺点，接下来本文将对双特异性抗体的不同结构进行简单介绍。

这是一种最简单的设计方法，是使抗体分子最小的结构，即在一个分子中简单地结合多个抗原结合位点，而不包含Fc区域，因此其结构与天然抗体差别较大，故也称非IgG样结构。由于结构简单且不含Fc区域，其生产较为容易，避免了链交联问题，只需简单地在真核或原核表达系统中同时表达两个多肽链，即可进行这种结构的双特异性抗体的生产[25]，而不需要化学偶联或组装步骤，提高了产量并降低了生产成本，为在细菌等表达系统中构建小分子二价双特异性抗体片段提供了方法。但不含Fc的双特异性抗体血浆半衰期较短，给药时需持续静脉滴注或使用缓释剂型给药，且由于片段较小可能出现稳定性差和易聚合失活的问题[26]。

(1) BiTE

双特异性T细胞衔接器(Bispecific T cell engaging，BiTE) 是典型的，也是结构最简单的不含Fc片段的双特异性抗体，如图 2B所示，它将两个单链抗体(Single chain Fv，scFv) 由短肽链连接，仅保留两个抗原结合位点以行使功能。虽然BiTE结构简单，但由于缺乏Fc片段，其血液半衰期较短，易于解离。1995年，Mack等[27]设计出了第一个BiTE，同时靶向T细胞表面CD3抗原以及上皮细胞表面17-1A抗原，后者是结直肠癌残留癌细胞的有效治疗靶点，将T细胞募集至肿瘤细胞表面，激活T细胞并杀伤肿瘤细胞。51Cr释放实验表明，该双特异性抗体在人类外周血T淋巴细胞与17-1A阳性的肿瘤细胞共存的环境中，纳摩尔浓度下即具有很高的细胞毒性。Blinatumomab (AMG103/MT103) 是首个FDA批准的BiTE药物，它能结合急性淋巴细胞白血病患者过度增殖的B细胞表面抗原CD19，在185例急性淋巴细胞白血病患者中，疾病完全缓解率为32%，中位缓解时间6.7个月，常见不良反应为发热、头痛、水肿等[28]。

(2) Diabodies

另一种常见的结构还有二价的抗体二聚体(Diabodies)，它由两个交叉的单链抗体ScFv组成，如图 2C所示，由于连接用的短肽链将每个轻链重链的可变区分隔开，所以只能形成二聚体。研究表明，二聚体抗体相较于亲代抗体的亲和力提高近10倍[21]。双亲和重定向分子(Dual affinity re-targeting，DART) 是一种典型的二价抗体结构，将一个抗体的重链可变区(Variable region of heavy chain，VH) 和轻链可变区(Variable region of the light chain，VL) 序列与另一个抗体的VL和VH序列分别连接，这种结构的常见问题是VH-VL的亲和力不强，易于解离[29]。已经报道的解决方法有在两条多肽链的C端引入半胱氨酸[30]，以在VH-VL间形成二硫键，提高抗体分子稳定性。Flotetuzumab是一种靶向CD123和CD3抗原的DART结构双特异性抗体，介导T细胞对急性髓系白血病细胞的杀伤。临床前研究中，Flotetuzumab在食蟹猴中耐受性良好，最大耐受剂量在1 μg/(kg·d)，开始治疗后72 h即观察到CD123阳性细胞的杀伤，不良反应包括细胞因子释放短暂增加，红细胞短暂减少，未观察到中性粒细胞或血小板的减少[31]。

含Fc片段的双特异性抗体与天然抗体结构类似，故又称为类IgG样结构双特异性抗体，即保留了Fc段的相应功能，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖的细胞毒性(Complement dependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖的细胞介导的吞噬作用(Antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP) 等，同时又具有双特异性。含Fc段的双特异性抗体后期纯化容易，分子量相对较大，具有较高的稳定性，但相应地其组织渗透率较低。此类结构主要包括Triomabs、杵臼结构(Knobs-into-holes)、双可变结构域免疫球蛋白(Dual-Variable Domain Immunoglobulin，DVD-Ig)、scFv2-Fc等。类IgG结构具有较长的血清半衰期，这是大多数生物应用所必须的。此外，还可以通过Fc的一系列突变来调节其与Fc受体的结合能力，从而调节双特异性抗体的半衰期[32]。与其他结构相比，类IgG结构与原始序列偏差最小，这简化了开发过程，并且降低了双特异性抗体的免疫原性。

(1) TrioMabs

TrioMabs双特异性抗体技术平台由德国Fresenius和Trion Pharma公司合作开发[33]。TrioMabs是保留Fc段结构的双特异性抗体，如图 2D所示，两条Fab段分别靶向T细胞表面CD3和肿瘤细胞表面抗原，Fc段则募集表达Fc受体的效应细胞，包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞等，形成功能复合体，刺激T细胞分泌细胞因子，并杀伤肿瘤细胞[34]。由于TrioMabs同时具有靶向肿瘤细胞、靶向T细胞以及招募Fc受体表达的效应细胞3种功能，故又称为三功能抗体。

(2) Knobs-into-holes

杵臼结构(Knobs-into-holes) 双特异性抗体技术由Genentech公司研发，具体原理是将亲代两种抗体其中一个的重链CH3区366位体积较小的苏氨酸突变为体积较大的酪氨酸，形成杵(Knobs) 结构，再将另一个抗体重链CH3区407位体积较大的酪氨酸突变为体积较小的苏氨酸，形成臼(Holes) 结构，再利用杵臼结构的空间结构互补特性，实现两种亲代抗体的正确组装，如图 2E所示。突变后的抗体正确组装率由野生型的57%提高至92%[35]，大大增加了正确组装的效率，满足了双特异性抗体规模化生产的要求。

(3) DVD-Ig

DVD-Ig结构由AbbVie公司研发，如图 2F所示，在正常抗体的轻重链可变区N端分别再连接上另一个抗体的轻链可变区和重链可变区，形成具有双可变区抗原结合位点的抗体，实现双特异性的功能[36]。这种结构的双特异性抗体与普通抗体有相同的Fc段，无需使用特殊方法生产，采用现有的通用抗体生产技术即可，大大降低了双特异性抗体的生产难度，提高了其应用价值。

由于人们不良的生活习惯，以及全球环境的恶化，近几年的肿瘤发病率不断升高，抗肿瘤药物的市场需求正在增加。双特异性抗体在肿瘤治疗中开辟了一个全新的领域，并且有着极其重要的意义。目前已有3种双特异性抗体药物获批上市，另有50多种双特异性抗体正处于临床试验阶段，超过85种处于临床开发阶段。接下来本文将对双特异性抗体在不同类型的肿瘤治疗中的应用进行综述。

肺癌在全球癌症发病率和死亡率排名中占第一位，每年约有160万人死于肺癌，是危害人类生命安全的第一大癌[37]。临床上把肺癌分为小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC) 和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占比约85%，是肺癌治疗中的首要研究对象[38]。NSCLC的治疗有过3个里程碑式的进展，分别是传统的化疗、靶向治疗和免疫治疗。手术切除是Ⅰ、Ⅱ期以及部分Ⅲ A期NSCLC患者最有效的治疗方法，然而术后复发率高，5年总生存率ⅠA期约83%，Ⅲ A期约36%。肺癌易转移，使得其死亡率较高，想要达到长期生存需要有效的全身治疗[39]。NSCLC的治疗多以靶向表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR) 为主。目前已经较成熟的靶向EGFR的抗体药物包括大分子的贝伐珠单抗[40]，以及小分子的EGFR-TKI[41]，这些抗体药物在治疗中的联用，较单纯化疗而言显著提升了疗效。

然而，相当一部分的NSCLC患者存在EGFR的外显子突变。EGFR基因由28个外显子组成，大多数突变发生在第18–21外显子处，其中外显子20的突变是EGFR三大突变类型之一，占所有EGFR突变的10%，常见于不吸烟者，与年龄、性别以及肿瘤分期等没有相关性[42]。EGFR的突变会导致NSCLC激活c-Met受体途径，从而获得对靶向EGFR疗法的耐药性。因此，美国强生与丹麦Genmab合作开发出针对EGFR和c-Met的双特异性抗体药物JNJ-61186372。Grugan等[43]在针对JNJ-61186372的研究中发现，该抗体在野生型及EGFR突变型的NSCLC中均具有抗肿瘤活性，且可以引起较强的ADCC作用，且在食蟹猴模型中未出现明显的毒副作用。2019年美国临床肿瘤协会(American society of clinical oncology，ASCO) 上公布了JNJ-61186372的Ⅰ期临床试验(NCT02609776) 数据[44]，在108例EGFR突变的晚期NSCLC患者中，疾病控制率(Disease control rate，DCR) 达到100%，客观缓解率(Objective response rate，ORR) 为30%，3级以上不良反应为9%。2020年3月10日，FDA授予肺癌新药JNJ-61186372 (JNJ-6372) 突破性治疗的称号，用于治疗EGFR外显子20插入突变，且经铂类化疗后持续进展的转移性NSCLC患者。这将是EGFR外显子20插入突变肺癌患者的首款免疫疗法。

JNJ-61186372的突破性成果将成为NSCLC治疗中的一个重要的里程碑，有望成为攻克EGFR突变型NSCLC耐药的重要武器。多种针对NSCLC的双特异性抗体药物正在进行临床前研究或临床研究[45-46]，期待未来将发现更多的肺癌治疗靶点，开发出更多的有效治疗药物。

在世界范围内，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，每8位女性中就会有1位患乳腺癌，是女性最主要的健康问题[47]。乳腺癌的治疗方法主要采用手术为主，放化疗及内分泌治疗为辅的综合治疗方法，随着免疫学的发展，以免疫治疗为基础的治疗手段正在成为乳腺癌治疗的重要形式[48]。乳腺癌的免疫治疗中有两大突破性进展，一是人源性单克隆抗体的应用，第一个应用于临床的单克隆抗体药物是Roche公司研制的抗HER2抗体Herceptin；二是目前正处于发展上升阶段的双特异性抗体介导的免疫治疗。

人表皮生长因子受体-2 (Human epidermal growth factor receptor 2，HER2) 是在20世纪80年代发现的，迄今为止乳腺癌中研究比较透彻的基因之一。25%的乳腺癌高表达HER2，是乳腺癌靶向治疗药物的重要靶点。HER2高表达的乳腺癌亚型预后差、进展快，主要治疗方法为抗HER2治疗[49]，针对HER2的嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T) 免疫治疗[50]和T细胞双特异性抗体(T cell bispecific antibodies，TCB)[51]都已经被研发出来，但HER2-CARs不仅可以靶向HER2阳性的肿瘤细胞，还可以靶向表达HER2的正常细胞，这导致了心肺衰竭等致命副作用[52]。因此Irene等[53]想找到一种肿瘤特异性抗原替代HER2，从而防止TCB抗体药物对正常组织的靶向性；他们发现，约40%的HER2阳性乳腺癌表达p95HER2，这是HER2的一个c端片段，在正常组织中不表达，且实验表明，p95HER2-TCB对正常组织不具有靶向性，由此防止了HER2-TCB的副作用，成为T细胞重定向和裂解肿瘤细胞的安全靶点。目前该抗体药物已经完成临床前研究，正在积极筹备临床试验。

ZW25是Zymeworks公司基于AzymetricTM平台开发的双特异性抗体，靶向HER2细胞外结构域2和4，对HER2阳性的患者有效且耐受性良好。2018年ASCO大会公布了ZW25的Ⅰ期临床试验(NCT04276493) 数据[54]，ZW25在多种HER2高表达的肿瘤中均具有有效性和良好的耐受性，20例乳腺癌患者的响应率为33%，且在HER2阳性的胃癌及其他实体瘤中也观察到了较好的治疗效果，总体ORR分别为44%和33%，且耐受性较好，仅有1例患者出现3级不良事件[54]。2019年5月29日，FDA授予ZW25快速通道资格，以加速ZW25联合化疗用于HER2高表达的肿瘤患者的研究。2020年1月12日，Zymeworks公司宣布启动ZW25与Pfizer公司的口服CDK 4/6抑制剂Ibrance (Palbociclib) 联合疗法的Ⅱ期试验(NCT04224272)，并与辉瑞合作共同推进研究。该联合疗法将用于接受过治疗的HR阳性、HER2阳性的局部晚期或转移性乳腺癌患者。

虽然近几年乳腺癌的预后情况得到了改善，5年总生存率达到87%[55]，但乳腺癌仍是女性中的第一大癌，诊断和治疗中的突破有赖于免疫治疗的临床转化，随着新的双特异性抗体药物的研发，乳腺癌的治疗手段正在不断优化与发展，以促进乳腺癌的免疫治疗疗效最大化。

前列腺癌是前列腺上皮细胞恶性增生所致，是一种常见的老年男性癌症，平均诊断年龄在68岁左右。前列腺癌的发病率有明显的地区差异，欧美地区较高，亚洲地区较低。前列腺癌的发病率和死亡率仅次于肺癌，是美国男性中第二致命的癌症类型[56]。目前前列腺癌的主要治疗方法是手术、放疗以及免疫治疗等。去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC) 是一种晚期前列腺癌，生存率低。大约10%–20%的前列腺癌患者在治疗后5年的随访期内，会发展成为去势抵抗性前列腺癌，常规的治疗手段已经对其失去效果[57]。

BAY2010112是Amgen公司开发的一种靶向前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen，PSMA) 和CD3的BiTE双特异性抗体，介导T细胞裂解肿瘤细胞。PSMA是一种跨膜糖蛋白，在所有阶段的前列腺癌组织中高表达，但在正常前列腺组织中表达较低，是诊断和治疗前列腺癌的理想靶点[58]。临床前研究显示，BAY2010112在体外可以特异性裂解多种人前列腺癌细胞系，且在小鼠实验中有良好的抗肿瘤活性，EC50为3.4–6.7 ng/mL[59]。此外，BAY2010112还可以抑制PSMA阳性癌细胞系在小鼠体内形成肿瘤。2019年ASCO大会公布了BAY2010112的剂量递增Ⅰ期临床试验(NCT01723475) 初步研究结果[44]，16例去势抵抗性前列腺癌患者连续静脉注射BAY2010112 (5–80 μg/d)，其中3例患者的前列腺特异性抗原降低量大于50%，另有2例完全缓解，1例与药物有关的严重不良事件。目前该实验仍在进行，用不同剂量治疗去势抵抗型的前列腺癌患者，目的是确定其安全性和耐受性，以及评估药物代谢动力学和临床疗效。

APVO414是由Aptevo Therapeutics开发的T细胞重定向双特异性抗体药物，用于去势抵抗性前列腺癌的治疗，同时靶向PSMA和CD3。在临床前研究中，APVO414显示出刺激T细胞增殖和增加其抗癌杀伤能力的作用。这些研究结果首次在2016年美国癌症研究协会(American association for cancer research，AACR) 年会上发表[60]，结果表明，体外实验中，APVO414在低浓度及低效靶比时即有较高的T细胞激活及介导肿瘤细胞裂解的作用。小鼠实验分析血浆半衰期为4 d，可以显著抑制小鼠体内肿瘤生长[61]。APVO414已于2019年8月完成了Ⅰ期临床试验(NCT02262910)，结果显示持续给药效果好于每周给药。

前列腺癌是男性高发癌症，且会在治疗后期发展为去势抵抗性前列腺癌，去势抵抗性前列腺癌的中位生存期仅为14个月左右，15%–33%患者会发生肿瘤转移[62]，增加了死亡风险，目前仍需要开发有效的治疗手段以满足临床需求，免疫疗法联合其他多种治疗手段的综合疗法，将会成为防治前列腺癌的重要手段。

结肠直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，在美国男性和女性癌症发病率中均排名第三位，在男性中仅次于肺癌及前列腺癌，在女性中仅次于肺癌及乳腺癌[37]。大约20%的结直肠癌患者在被确诊时已经出现转移，对于不可切除的转移性结直肠癌患者，治疗通常使用化疗联合氟吡嘧啶、奥沙利铂或伊立替康的方法，但转移性结直肠癌患者的预后总体仍然非常差，5年生存率只有6%–8%左右[63]，因此，迫切需要治疗结直肠癌患者的新方法。

MGD007是MacroGenics公司研发的一种新型的gpA33×CD3双特异性抗体，以糖蛋白A33 (Glycoprotein A33，gpA33) 阳性细胞为靶标，通过与表达CD3的T淋巴细胞的共同结合，实现识别和清除gpA33阳性的结直肠癌细胞。gpA33在95%的原发性和转移性结直肠癌中表达，是结直肠癌免疫治疗中具有潜力的靶点[64]。体外实验表明，MGD007介导了T细胞对表达gpA33的结直肠癌细胞系的重定向杀伤。对食蟹猴进行的临床前毒理学研究表明，MGD007可以每周重复给药的情况下保障安全性[65]。MGD007目前已进行Ⅰ期临床试验(NCT02248805)。

OMP-305B83是OncoMed研发的一种靶向DLL4 (Delta-like ligand 4) 和VEGF的双特异性抗体，DLL4在Notch-DLL4肿瘤干细胞信号通路中起重要作用，血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF) 是促进血管生成的主要生长因子，OMP-305B83可以抑制血管生成，引发有效的抗肿瘤反应。Ⅰ期临床试验(NCT02298387) 表明，OMP-305B83可安全使用，毒副作用可控，在多种肿瘤类型(卵巢12例、结肠直肠11例以及乳腺癌、胰腺癌、子宫癌和子宫内膜癌各4例) 中显示出初步的抗肿瘤活性[66]。2019年7月，FDA已授予OMP-305B83快速通道认证，并同意了OMP-305B83的Ⅱ期临床实验设计，该研究正在积极筹备中。

虽然结直肠癌的手术疗法、放化疗等技术在逐渐提高，但是大部分进展期的结直肠癌的有效治疗方法仍是免疫治疗，通过对治疗靶点和双特异性抗体药物的研究，免疫治疗将在结直肠癌的治疗中发挥重要的作用。

胃癌的发病率有着明显的地域差别，亚洲国家的胃癌发病率和死亡率明显高于欧美非洲等国家[67]。由于工作压力大，饮食结构改变等原因，胃癌的发病率正在趋于年轻化。2019年国家癌症中心发布全国癌症统计数据显示，胃癌发病率居我国恶性肿瘤发病率第二位。由于胃癌早期无明显症状，我国胃癌的早期确诊率仍较低，大部分患者确诊时已是晚期，且预后较欧美发达国家仍有差距，中国的胃癌死亡率是美国的1.7倍(P < 0.001)[68]。早诊早治，晚期规范治疗，是我国胃癌诊疗亟待解决的问题。

细胞程序性死亡受体1 (Programmed cell death protein 1，PD1)、细胞程序性死亡配体1 (Programmed cell death 1 ligand 1，PDL1)、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4 (Cytotoxic T lymphocyte- associated antigen-4，CTLA-4) 单抗在各个肿瘤的免疫治疗中均有一席之地，但单抗药物疗效有限，且对部分肿瘤没有明显疗效。AK104是康方生物研发的国际上首个进入临床试验的CTLA-4/PD1双特异性抗体。2019年癌症免疫治疗协会(Society for immunotherapy of cancer，SITC) 年会公布，澳洲开展的AK104 1A期递增剂量临床试验(NCT03261011) 中，21位可进行疗效评估患者的DCR为47.6%，ORR为28.6%[69]。2020年AACR会议公布的AK104的Ⅱ期临床试验(NCT03852251) 中，AK104联合疗法治疗胃癌的控制率在94.7%，其中1例患者达到完全缓解，部分患者的最长给药时间超过42周，13例患者仍在接受治疗[70]。截至2020年4月2日，ORR达到57.9%，DCR为94.7%。实验结果显示，AK104治疗中，3级及以上的不良事件发生率为9.5%，安全性较PD1、CTLA-4单抗明显提升。康方生物表示，未来还会进行多个AK104单独治疗以及AK104联合治疗的临床试验，力争早日上市。

胃癌的发病率高、预后差，缺乏有效的治疗方法，近年来随着免疫疗法的飞速发展，双特异性抗体药物给胃癌治疗带了革命性的改变，也给胃癌患者带来了希望。但免疫治疗靶点的选择以及早期诊断仍是胃癌治疗中亟待解决的问题。

膀胱癌是一种常见的泌尿系统肿瘤，中国膀胱癌的发病率在泌尿系统肿瘤中居于首位，术后复发和转移是导致患者死亡的主要原因[71]。30年来，膀胱癌的临床治疗一直使用相同的、有限的治疗方法，亚太地区患者的5年生存率为81.9%[72]，但是近年来，免疫检查点抑制剂的使用及膀胱微生物群的发现，都有望改善膀胱癌的治疗方法，以为患者提供更加持久的缓解[73]。

B7H3 (B7 homolog 3) 也称CD276，高表达于多种肿瘤类型，已被证明可以促进肿瘤的发展。Ma等[74]合成了抗B7H3的BiTE，体外实验表明，B7H3-BiTE作用可以有效的介导T细胞杀伤肿瘤细胞，且可以诱导IFN-γ和TNF-α的产生[75]。此外，通过激活PI3K/Akt/STAT3信号通路，B7H3可以促进膀胱癌细胞的侵袭和转移。这些结果表明B7H3可能是膀胱癌治疗的有效靶点。该团队的另一项研究[76]表明，B7H3-BiTE可以有效地将T细胞重定向到膀胱癌细胞，且实验组的T细胞高表达早期激活标志物CD69，这些结果表明，B7H3-BiTE可以激活T细胞并使其杀死肿瘤细胞，且在耐药细胞株中仍有杀伤作用。小鼠试验表明[76]，B7H3-BiTE可以有效地抑制皮下和肺转移性异种移植小鼠肿瘤的生长并延长了其生存时间。目前该抗体正处于临床前研究阶段，旨在为膀胱癌的治疗提供有效的方法。

随着膀胱癌治疗的研究重点转变为免疫调节治疗，膀胱癌的免疫疗法的研究还仅仅是个开始，多种有效的治疗靶点已经被发现[77]，双特异性抗体在膀胱癌治疗中有着巨大的潜力与广阔的应用前景。

淋巴瘤是一种免疫系统的实体瘤，其中霍奇金淋巴瘤约占10%，其余90% 左右均是非霍奇金淋巴瘤[78]。非霍奇金淋巴瘤有广泛的组织学表型和临床特征，使得其诊断非常困难[79]。非霍奇金淋巴瘤的主要症状是淋巴结、脾脏、胸腺等淋巴器官的病变，依据病变细胞类型分为B细胞、T细胞、自然杀伤T细胞非霍奇金淋巴瘤，临床约70%–85%为B细胞非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤的治疗先后经历了传统的化疗及免疫化疗联合疗法，目前的免疫疗法主要有免疫检查点抑制剂、CAR-T以及双特异性抗体等手段。

CD20-BiTE在淋巴瘤治疗领域中有着极其广阔的应用前景，目前国外已有多个CD20-BiTE处于临床试验阶段，并在B细胞非霍奇金淋巴瘤中显现出了较好的治疗效果。2018年美国血液病学会(American society of hematology，ASH) 上宣布了REGN1979在治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤中的Ⅰ期临床试验(NCT02290951) 数据[80]。该药物由Regeneron研发，同时靶向CD20和CD3抗原。10例复发性难治性非霍奇金淋巴瘤患者的ORR为100%，其中80%达到了完全缓解。该药物下一步计划开展Ⅱ期临床试验，并继续进行剂量递增试验。

RG6026是罗氏研发的一种CD20-TCB，与其他CD20双特异性抗体相比具更强的CD20亲和力，也相对有更好的治疗效果。在Ⅰ期剂量递增临床试验(NCT03075696) 中，共87例患者接受了600 μg至25 mg RG6026给药剂量的治疗，包括非霍奇金淋巴瘤79例、滤泡性淋巴瘤8例。非霍奇金淋巴瘤组ORR为46%，完全缓解率(Complete response，CR) 为29%，在高剂量组(10–25 mg给药剂量) 中，ORR为55%，CR为37%，表明RG6062治疗效果存在剂量依赖性。整个实验过程中，未发现耐药性个体，外周血和肿瘤活检发现T细胞持续激活且快速增殖，侧面体现了RG6026的抗肿瘤作用机制[81]。

淋巴瘤是血液系统疾病中最为常见的肿瘤之一，而非霍奇金淋巴瘤又占其中的绝大部分，针对非霍奇金淋巴瘤的双特异性抗体药物正处于发展时期，在非霍奇金淋巴瘤治疗领域中正显示出极为广阔的应用前景，值得期待双特异性抗体给非霍奇金淋巴瘤带来更多的治疗效益。

多发性骨髓癌是一种恶性血液肿瘤，目前无治愈方法，它的成因在于B细胞的失控增殖。多发性骨髓癌的死亡率极高，中位生存期不到5年[82]。致病机理复杂，动物模型有限，缺乏表面有效靶点，使得多发性骨髓癌的疗法开发有着许多挑战。2015年，针对多发性骨髓癌的靶向CD38和靶向SLAMF7的两款单克隆抗体经过3期临床试验表明其有效性和安全性，被批准用于治疗复发性和难治性的多发性骨髓癌[83]，是其免疫治疗方面的突破性进展。然而这两种抗原在正常组织中也有表达[84]，这限制了它们的临床实用，亟待研发基于其他靶点的抗体药物。

EM801是EngMab研发的一种B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA) 靶向的TCB，BCMA是肿瘤坏死因子受体超家族17中的一种跨膜糖蛋白，在所有多发性骨髓癌患者的癌细胞中均有明显的高表达，但在正常浆细胞以及正常组织中不表达，可以作为多发性骨髓瘤的治疗靶点。实验表明，EM801可以增加CD3阳性T细胞与骨髓瘤细胞的交联，此外还可以增加CD4阳性和CD8阳性T细胞的激活，增加IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素的分泌[85]。目前EM801仍在进行临床前研究，对于临床试验也在积极准备。

JNJ-7957是Johnson & Johnson旗下子公司Janssen的靶向BCMA和CD3的双特异性抗体，用于复发性/难治性的多发性骨髓瘤治疗。临床前研究[86]显示，JNJ-7957在4株多发性骨髓瘤细胞系，48名患者的肿瘤样本，5名原发性B细胞白血病中存在有效抗肿瘤活性。高T细胞密度或高效靶比会促进JNJ-7957的抗肿瘤活性，PD1/PDL1信号通路对其影响不大。JNJ-7957的Ⅰ期剂量递增临床试验(NCT04108195) 目前正在进行，详细数据尚未发布。

Amgen公司AMG420是靶向BCMA的BiTE双特异性抗体，在首次人体试验中，42例复发性/难治性多发性骨髓癌患者有25例停止疾病进展，7例发生不良事件，4例死亡，3例完成10个用药周期，1例退出，2例仍在治疗。其中2例死亡是由AE、流感/曲霉病和腺病毒相关肝炎引起的，2例由多发性神经病变引起，ORR为31%，最大耐受剂量400 μg/d，整体响应率70%，有效性及安全性在可接受范围内[87]。目前AMG420的Ⅰ期临床试验(NCT03836053) 正在进行中。

多发性骨髓瘤的免疫疗法正在迅速发展，多种双特异性抗体药物在进行临床研究，有望给患者提供有效的治疗，成为抗击多发性骨髓瘤的新武器。

白血病是一种血液和骨髓的恶性肿瘤，常见于青少年和青壮年人群中[88]。白血病按发病情况分为急性白血病和慢性白血病，急性白血病平均生存期短，若不经积极治疗，甚至诊断数天后即死亡，而慢性白血病的预期寿命在1–3年左右[89]。急性白血病按照发病细胞及发病机制进行分型，而不是根据病程进展，例如常见的急性白血病有急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性单核细胞白血病等。

AMG330是Amgen公司研发的一种靶向CD33的T细胞重定向双特异性抗体，体外实验显示可以激活T细胞，使其表达CD69、CD25，释放细胞因子IFN-γ、TNF-α以及IL-2等。CD33是一种细胞表面的跨膜糖蛋白，在大于90%的急性髓细胞白血病患者的癌细胞中表达[90]。目前，针对CD33的免疫治疗已有很多种，包括单克隆抗体，抗体-药物联合治疗，T细胞重定向的双特异性抗体等[91]。小鼠实验中，AMG330的治疗显著延长了人T细胞过继移植的免疫缺陷小鼠的生存期[92]。但由于少部分健康的骨髓细胞也表达CD33，导致了CD33靶向治疗有一定的肿瘤外毒性。AMG330的Ⅰ期临床试验(NCT02520427) 正在进行，目的是确定AMG330在复发性/难治性急性髓系白血病中持续静脉给药在成人受试者中是否安全且可耐受，并确定最大耐受剂量和/或生物活性剂量。这项研究将在多个地点进行，并进行剂量递增试验。

2014年，美国FDA批准了Amgen公司研发的CD19靶向的BiTE blinatumomab用于复发性/难治性的急性淋巴细胞白血病的治疗，2015年，欧盟也批准该药上市。Ⅱ期临床试验(NCT01466179) 中，189名复发性/难治性白血病患者接受了5个周期，每个周期4周的持续静脉给药治疗，阳性受试者接受了blinatumomab治疗，CR为40%，2%的患者出现了3级不良事件。5年的随访数据表明，接受blinatumomab治疗可以使患者达到MRD (急性淋巴细胞白血病复发的重要预测因子) 阴性的完全缓解，延长生存期，中位总生存期达36.5个月[93]。

双特异性抗体药物在复发性/难治性白血病中治疗中初见成效，随着对白血病生物学特征与治疗靶点研究的深入，双特异性抗体有望联合常规治疗，提高白血病患者缓解率，延长生存期。

双特异性抗体是具有两个不同的抗原结合位点的抗体，相比于传统的单克隆抗体，有更好的敏感性和特异性。自1960年Nisonoff等[1]首次提出双特异性抗体的概念以来，双特异性抗体药物正开启着分子医学的新领域。但目前已获批上市的双特异性抗体药物仍较少，大多数药物处于临床前开发阶段或临床研究阶段(表 1)。由于双特异性抗体在肿瘤免疫中存在巨大的潜力，目前的研究重点集中在肿瘤治疗中。

肿瘤是严重危害人类生病健康的疾病之一，随着全球环境的恶化以及人们不规律的生活习惯，癌症的发病率越来越高，情况不容乐观。传统的肿瘤治疗方法往往不能彻底根治，还可能会导致肿瘤的复发和进展。肿瘤免疫疗法是近几年新兴的肿瘤治疗方法，通过激发免疫系统自身的能力来清除肿瘤细胞，其中双特异性抗体药物就是一个极具潜力及发展前景的免疫治疗药物。

双特异性抗体相比于普通抗体，在肿瘤治疗方面显示出较大的优势。双特异性抗体在肿瘤治疗中的一个重要机制就是介导免疫细胞杀伤，同时靶向肿瘤抗原与效应细胞抗原，激活效应细胞杀伤靶细胞。此外双特异性抗体还可以进行双靶点信号同时阻断，有效防止肿瘤耐药性的产生。双特异性抗体有许多结构，它们影响到抗体分子的合成、半衰期、Fc介导的免疫效应等，根据临床适应症选择合适的抗体结构，将对免疫治疗产生重要助益。

目前双特异性抗体在多种肿瘤类型治疗中的应用处于临床前研究或以进入临床研究阶段，但仍存在许多挑战，包括抗体产品产量低、纯化过程复杂、临床转化困难、仍存在一定的肿瘤外靶向的毒副作用等。国内对双特异性抗体的研究仍处于发展阶段，随着科技的发展与研究的深入，相信双特异性抗体在肿瘤治疗领域仍有很大的发展空间，为癌症治疗带去希望。