单细胞转录组：Smart

「深圳市易基因科技」单细胞转录组：Smart-seq 2还是10x Genomics Chromium?

应用单细胞测序技术研究科学问题越来越普遍，当下应用最火热的是10x Genomics公司的Chromium解决方案（以下简称10X）。但是基于2017年Christoph Ziegenhain et al[1]对6种单细胞转录组技术及2019 Broad研究所的团队对7种单细胞RNA测序方法进行了比较[2]，某些特殊或者少量细胞样本的单细胞转录组研究中，Smart-seq2技术还是一项研究利器。Smart-seq2与10x技术的区别与应用的科研场景有哪些呢？北京大学张泽民团队在2019年发表的预印文章“Direct Comparative Analysis of 10x Genomics Chromium and Smart-seq2”中给予了答案。那么今天小编再次对Smart-seq 2与10x Genomics Chromium的技术原理和应用进行阐明。

Smart-Seq简介

Smart-Seq (Switching mechanism at 5' end of the RNA transcript)于2012年发表[3]，2013年发表了其改进技术的应用Smart-Seq2[4]，2014年Smart-Seq2 protocol发表[5]。Smart-Seq2 对原始的Smart-Seq实验流程进行了多项改进优化，它不再需要纯化步骤，可大大提高产量，最重要的改进是下面两项：

· TSO 3'端最后一个鸟苷酸替换为锁核酸LNA(locked nucleic acid)。LNA单体的热稳定性增强，其退火温度增强非模板cDNA的3'延伸能力

· 甜菜碱（一种具有两个重要作用的甲基供体：它会增加蛋白质的热稳定性，并通过破坏DNA螺旋来降低甚至消除了DNA热融变对碱基对组成的依赖性）与较高的MgCl2浓度结合使用。解决某些RNA形成二级结构（例如发夹或环）由于空间位阻，可能导致酶终止链延长的问题

Smart技术是基于高保真的反转录酶、模板转换和前置放大来增加cDNA得率，实验流程2天，得到的是全长转录本。该方法有较好的覆盖范围，可检测到稀有转录本，不需要额外的专业设备，因此应用范围较广。

Smart-Seq2建库原理

1. 单细胞分选：Smart-seq2使用流式细胞仪或显微操作进行细胞分选，体积不超过0.5 ul。

2. 细胞裂解：将分离细胞直接转移到细胞裂解液中进行细胞裂解。

3. 反转录（ 一链合成 ）：使用Oligo(dT) primer 对带有polyA尾的RNA( 主要mRNA )进行反转录。由于使用了特殊活性反转录酶( Moloney Murine Leukemia Virus )进行反转录，所以会在cDNA链3'端加上三个C。

4. 模板置换（ 二链合成 ）：该步使用TSO ( template-switching oligo )引物合成了cDNA的二链，从而置换了与一链cDNA互补的RNA。要注意的是TSO 3'端有三个G能与一链3'端的三个C互补，而最末端的+G是一个修饰过的G，能增加TSO的热稳定性，以及其与一链cDNA游离的3’端的互补的能力。

5. PCR扩增：该步进行轻度的cDNA富集，将cDNA扩增至ng级即可。

6. 标记：利用改造后的高活性Tn5转座酶对DNA进行打断的同时将接头添加到cDNA的两端。标记完成后的DNA片段通常在200-600bp。

7. PCR富集及上机测序：在进行最后一次PCR扩增后，即可上机测序。

10x Genomics单细胞技术

ChromiumTM Single Cell 3' Solution是基于10 X Genomics平台，能够一次性分离、并标记5000–10000个单细胞，并能在单细胞水平进行检测的技术。该方法基于微流控技术（Microfluidics-based approaches），与Smart有相似的分子生物学原理，运用了模板转换技术，但与Smart的细胞捕获和通量不同。droplet-based方法是将单个细胞包裹在一个小油滴中（含有barcode和RT primer）反转录成cDNA，然后油滴破裂释放cDNA，统一进行文库构建，增大了实验通量，但需要专门的实验设备。

10x Genomics建库原理

1. 制备好的细胞悬液、10x barcode凝胶磁珠和油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室，经由微流体“双十字”交叉系统形成GEM。为了获得单细胞反应体系，细胞悬液浓度建议控制在700-1200细胞/ul，因此产生的90-99% GEM不含有细胞，剩下的大部分GEM含有一个细胞。

2. 单个GEM依次形成后再全部混合，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量引物序列。

3. 释放的引物中包含30nt poly dT反转录引物，带有polyA的RNA被反转录为带有10x Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART方式完成二链合成。

4. 油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后PCR扩增cDNA。

5. cDNA扩增完成后酶切片段化并磁珠筛选最适片段，通过末端修复、加A、接头连接Read2测序引物，再以PCR方式构建含有P5和P7接头的cDNA文库即可。

>Smart-Seq2 优点和限制

优点

· Smart-seq2利用现成的试剂比广泛商用的SMARTer kit生产更高质量的文库，成本便宜~12%，为分析大量细胞提供了可能性

· 相对于截短的cDNAs，M-MLV逆转录酶更倾向于选择全长cDNAs作为其末端转移酶活性的底物。因此每个转录本的所有外显子都能被检测到，这使它可以用于检测可变剪接，还可以在转录本层面进行全面的SNP和突变分析，扩大了其应用范围

· 不同I5、I7 Index组合使其能够进行多样品混合测序

· Smart-seq2的方案组分和原理是公开的，让研究人员可以进一步对其进行改良，目前在这个方案基础上涌现了许多单细胞测序的新成果

· 相对于10x Genomics 平台，单细胞检测到的转录本更多

限制

· 由于对聚腺苷酸化的RNA具有选择性，所以不能分析非poly(A)的RNA

· 测序reads不带有mRNA链特异性

10x Genomics优点和限制

优点

· 简单便捷：集单细胞分选、扩增、建库于一体；

· 细胞通量高：每个样本细胞数可达5000-10000个；

· 建库周期短：1天可完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增及建库；

· 超高捕获效率：单细胞捕获效率高达65%；

· 真正意义的单细胞：单个液滴捕获到多个细胞的概率极低（0.9%/1000cells）；

· 价格实惠：相较于其它单细胞平台，价格实惠。

缺点

· 非全长信息：只能获得3’端转录本信息；

· 样本要求高：单个样本细胞起始量达5x10^4-10^5个，活细胞数目需超过80%，建议在90%以上最佳。

数据差异

张泽民团队通过直接比较两个平台上来自相同CD45细胞样本的scRNA-seq数据，广泛系统地分析评估了各自数据特征。 Smart-seq2在细胞中检测到更多的基因和更为复杂的数据集，尤其是丰度较低的转录本以及可变剪切的转录本，但捕获了更高比例的线粒体基因。 Smart-seq2数据的组合也更类似于bulk RNA-seq数据。

尽管都是基于poly（A）富集策略，两个平台检测到的所有转录本中约有10-30％来自非编码基因，而lncRNA在10x中所占的比例更高。

Smart-seq2具有更高的敏感度，检测到的表达基因数目远高于10x的检测到的表达基因数目。

对于检测到的基因，Smart-seq2数据呈单峰分布，在所有细胞中检测到的低表达基因很少。相比之下，10x的数据由于有大量的接近零表达的基因，呈现出明显的双峰分布，说明10x数据中mRNA在很低的表达水平上有较高的噪声或随机捕获。

基于10x的数据显示出更严重的dropout问题(dropout是scRNA-Seq数据的一大特点，就是很多基因在某些细胞根本就检测不到表达，但是在另外的细胞却检测为高表达。通常认为这个dropout是因为在文库构建的过程中，有部分基因没有被成功的反转录。)，尤其是对于表达水平较低的基因。

10x 技术测序数据由于技术特色在mRNA的3’端有着较强的bias，而Smart-seq2技术则在gene上有着更为均一的分布。同时， 10x技术数据在splicing分析层面并不适用。

但是，由于10x数据能够覆盖大量细胞，因此可以更好地检测稀有细胞类型。此外，每个平台检测到的细胞簇之间差异表达基因的不同集合，表明这些技术是具有互补性的。

参考文献

1. Ziegenhain, C., et al., Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol Cell, 2017. 65(4): p. 631-643 e4.

2. Vieth, B., et al., A systematic evaluation of single cell RNA-seq analysis pipelines. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 4667.

3. Ramskold, D., et al., Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.Nat Biotechnol, 2012. 30(8): p. 777-82.

4. Picelli, S., et al., Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods, 2013. 10(11): p. 1096-8.

5. Picelli, S., et al., Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc, 2014. 9(1): p. 171-81.

6. Bjorklund, A.K., et al., The heterogeneity of human CD127(+) innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing. Nat Immunol, 2016. 17(4): p. 451-60.

7. Lambrechts, D., et al., Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment. Nat Med, 2018. 24(8): p. 1277-1289.

8. Zhang, Q., et al., Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma. Cell, 2019. 179(4): p. 829-845 e20.