Ⅰ型前胶原氨基端肽化学发光免疫分析检测方法的建立及评价

骨质疏松是一种世界常见病，全球大约有超过2亿名患者。随着我国老龄化社会的加剧，老年人口日益增长，骨质疏松已经逐渐发展为一种多发病，是引起老年人骨骼伤痛、骨损伤和生活质量恶化的主要原因[1-2]。因此，对于骨质疏松的早期诊断筛查已经成为研究的热点内容。骨质疏松由机体骨代谢紊乱引起，骨骼作为人体的主要器官，时刻不停地进行着新陈代谢，包括吸收代谢和合成代谢两部分，正常状态下二者处于平衡状态。当骨吸收异常亢进，吸收速率大于合成速率时，平衡状态被破坏，就会引起骨代谢紊乱、骨骼结构损伤[3]。国际上确诊骨质疏松的金标准检测方法是骨密度监测，但骨密度反应的是骨骼形态学的改变，往往需要几年时间才会发生变化，因此不能及时反馈人体骨骼生长情况和骨质疏松相关药物的治疗效果，并且骨密度检测仪器成本较高，特定医院才会配置，不适合大范围推广[4]。

近年来血清标志物在骨质疏松的辅助诊断中起着越来越重要的作用，但常规检测指标不够完善，操作复杂且影响因素多，缺乏特异性。研究表明[5]，Ⅰ型前胶原氨基端肽(PINP) 是一种高度特异性的骨代谢血清标志物，能够快速准确反映人体骨骼变化情况，可以用于骨质疏松的诊断筛查和相关药物治疗效果的临床监测。PINP即Ⅰ型胶原合成时氨基末端被切割后产生的一段多肽，由两条α1链和一条α2链组成，呈螺旋三聚体结构。Risteli等[6]研究发现，血液中的PINP稳定存在，食物和昼夜节律不会影响其浓度改变，当骨代谢紊乱时，PINP的浓度异常变化。高骨转化性疾病通常与PINP的异常表达有关，如软骨病、佩吉特氏病(Paget disease)、原发和继发性甲状旁腺功能亢进等[7]。血清PINP浓度的测定在评价骨代谢疾病、肿瘤骨转移疾病、内分泌紊乱和浆细胞骨髓瘤等疾病时同样起着重要的作用[8-9]。因此，PINP作为骨代谢检测指标，可以有效反映机体骨质的修复型状态，为骨质疏松等疾病的监测提供可靠的依据。

目前PINP的检测手段有放射性免疫检测法和化学发光检测法，放射性免疫检测法灵敏度低，而且有一定局限性。化学发光法既有免疫反应的特异性，又有高敏感性，以发光物质为示踪物，灵敏度高、线性范围宽、重复效果好、操作方便，在体外诊断行业得到了广泛应用[10]。目前国外市场上有罗氏诊断公司生产的PINP电化学发光法检测试剂盒和Orion诊断公司生产的PINP放射性免疫分析检测试剂盒出售。国内暂无相关PINP检测试剂盒的研究，因此临床上只能依赖进口厂商提供的检测试剂。本研究以制备的PINP-α1链重组蛋白为抗原，利用杂交瘤技术获得针对PINP-α1链的单克隆抗体，利用磁微粒化学发光平台，建立了一种检测PINP的磁微粒化学发光免疫分析法，以期能够实现对骨代谢疾病的辅助诊断。

大肠杆菌DH5α、谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647，由本实验室保存；BALB/c小鼠：4周龄，清洁级，购自江南大学动物实验中心；HisTrap HP亲和柱纯、Ni-NTA凝胶层析、链霉亲合素偶联磁微粒(直径0.9 μm)，购自GE公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)，购自Sigma公司；标准蛋白分子量Marker、生物素化标记试剂、辣根过氧化物酶(HRP)、TMB显色液，购自Thermo Fisher公司；160例临床血清样本，由无锡市人民医院提供；化学发光底物液A液(异鲁米诺、TRIS) 和B液(硼砂)，本实验室自制；PINP电化学发光检测试剂盒，购自美国罗氏诊断公司。

AKTA avant25蛋白纯化系统，GE公司；Elecsys E601全自动免疫分析仪，美国罗氏诊断公司；CIA600化学发光测定仪，江苏泽成生物技术有限公司；洗板机，英国Anthos公司，型号Fluido 2；旋涡混匀器，北京倍爱康生物技术有限公司，型号MIXER-I；生化培养箱，上海坤天实验仪器有限公司，型号SPX-80B。

PINP-COL1A1基因序列经过密码子优化后交由苏州金维智公司合成(GenBank登录号：X00820.1)。合成序列在5′端添加谷氨酸棒状杆菌的内源信号肽cspB，3′端添加6×His标签，并最终通过Hind Ⅲ和EcoRⅠ克隆至表达载体pXMJ19中。重组载体首先转化至大肠杆菌进行筛选，然后将测序正确的阳性载体转化至谷氨酸棒状杆菌CGMCC1.15647中诱导表达，IPTG终浓度为1 mmol/L。培养36 h后，离心收集发酵液上清。蛋白纯化按照以下步骤进行：收集含有PINP-α1链的发酵上清液并利用AKTA蛋白纯化系统和HisTrap HP亲和柱纯化上清中的目的蛋白。最后采用SDS-PAGE分析和罗氏电化学发光检测系统分别对蛋白纯度和活性浓度进行测定。

取PINP-α1链重组蛋白与KLH偶联形成抗原并与弗氏完全佐剂乳化，乳化完全后免疫BALB/c小鼠3只，抗原免疫量为35 μg/只，每2周进行1次，共进行3次。最后1次免疫后的第7天取小鼠血清进行效价检测，达到融合标准后取出脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0) 融合，利用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶(Hypoxanthine-aminopterin- antinthymidin，HAT) 培养基对杂交瘤细胞进行选择培养，2周后吸取细胞上清，采用酶联免疫检测方法筛选阳性细胞株。利用有限稀释法进行阳性细胞株克隆培养以获得可稳定分泌抗PINP-α1链的细胞株。取BALB/c小鼠，采用体内诱生法制备腹水型单抗，通过Protein G柱将腹水抗体进行亲和纯化。

生物素化捕获抗体制备：抗体用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH 8.0) 稀释到1 mg/mL，取1 mg的生物素化试剂(NHS-LC-LC-Biotin) 溶解于上述溶液中。室温下持续搅拌。4 ℃条件下，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 透析8 h，以除去游离的生物素，透析期间更换液体4次。将透析后的抗体溶液通过1 mL分子筛层析柱，以0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 缓慢洗脱，收集生物素化的PINP-α1链抗体。加入等体积甘油后分装，–20 ℃冰冻避光保存。

辣根过氧化物酶标记检测抗体：取辣根过氧化物酶(HRP) 溶解于1.25%戊二醛溶液中，室温过夜。反应后的酶溶液通过脱盐色谱柱，用生理盐水洗脱，收集棕色流出液。取2.5 mg待标记抗体，用磷酸盐缓冲液稀释至1 mL，逐滴加入HRP溶液中并搅拌。加入1 mol/L碳酸钠缓冲液(pH 9.5) 0.25 mL和0.2 mol/L赖氨酸0.25 mL，混合均匀，室温放置2 h。加入2.5 mL饱和硫酸铵，4 ℃静置60 min。4 000 r/min离心20 min，除上清，半饱和硫酸铵清洗沉淀物2次后溶解于少量0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 中。于0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4) 透析8 h，透析期间更换液体4次。透析后加入等体积甘油分装后，–20 ℃冰冻避光保存。

标准品制备：将PINP-α1链抗原用磷酸盐缓冲液(pH 7.5) (含2%牛丙种球蛋白，0.5%小鼠血清) 配制成1 200、600、300、50、10、0 ng/mL共6个工作校准品溶液，分装后–20 ℃冻存。

以Western blotting方法验证抗体特异性，取25 μg PINP-α1链蛋白加入至上样缓冲液中，样品沸水煮5 min后进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完成后将含有目的蛋白的胶条于250 mA恒流转膜1.5 h (0.4 μm硝酸纤维素膜)，封闭液TBST (含5%脱脂牛奶) 室温封闭2 h，将标记HRP的PINP-α1链单抗以封闭液1︰1 000进行稀释，室温孵育1 h，加入底物显色。以1株单抗为包被抗体，其余单抗为检测抗体，将PINP-α1链抗原配制成P6 (1 200 ng/mL) 和P3 (100 ng/mL) 两个检测样本，采用双抗体夹心酶联免疫检测方法对抗体进行配对筛选。

捕获抗体与检测抗体浓度的选择：采用棋盘滴定法[11]，将生物素化捕获抗体配制成0.1、1、1.5、3、5、10 μg/mL共6个浓度梯度；HRP标记的检测抗体配制成0.5、1、3、5 μg/mL共4个浓度梯度，以PINP-α1链抗原(1 200 ng/mL) 为检测样本，用建立的检测方法进行信号值测定。

最佳反应时间的选择：以确定工作浓度的捕获抗体和检测抗体对PINP-α1链抗原进行检测，设置5个不同的孵育时间(8、10、20、30、40 min)，选择信号值接近最高值的时间为最佳反应时间。

采用双抗体夹心化学发光法测定血清中PINP的含量。取40 μL样本或校准品加入平底试管中，加入80 μL捕获抗体和80 μL检测抗体，振荡器混匀2 min。在37 ℃培养箱避光反应30 min，取35 μL偶联链霉亲和素的磁微粒加入平底试管中，振荡器混匀2 min，37℃避光反应7 min，磁板架上静置2 min，磁微粒沉淀后，去除上清。取300 μL清洗液加入试管中，振荡器混匀2 min，磁板架上静置2 min，去除上清，此清洗步骤重复进行5次。取化学发光底物液A、B等比例混合，向试管中各加入200 μL底物液，立即放入化学发光测定仪检测。检测结果利用化学发光免疫分析仪数据管理软件分析处理，通过四参数Logistic方程生成PINP标准曲线，将样本信号值代入标准曲线中计算浓度。

最低检测限：重复测试校准品1 (0 ng/mL) 20份，计算信号平均值x，和标准差s，参考最低检测限测定方法，将x+2s带入建立的PINP标准曲线进行计算，得到的浓度值即为本方法的最低检测限。

精密度：根据NCCLS EP5-A2文件，用本文建立的方法对高、低浓度的2个血清样本进行检测，选取3个不同批次(20200910、20201010、20201210) 的试剂每天重复测定2次，连续测定20 d，分别计算批内、批间的变异系数。

线性范围：选取通过罗氏PINP检测系统定值的高值血清样本(1 150.45 ng/mL) 倍比稀释得到系列样本浓度作为预测值，每个样本重复测试2次，所有测试在同一次运行中完成，计算平均值记录为实际浓度值，将预测值作为X轴，实际值作为Y轴，进行结果的线性回归分析，将曲线拟合结果较好的区间作为检测方法的线性范围。

准确度：将浓度为8 500 ng/mL、5 000 ng/mL、500 ng/mL的PINP-α1链抗原各取0.1 mL，分别加入到1 mL浓度为10 ng/mL的PINP血清样本中，每个样品重复测定3次，以均值浓度计算回收率，回收率=(检测样本测定浓度-基础样本测定浓度)/添加物浓度×100%。

临床评价：从无锡市人民医院检验科选取分布在检测范围内的160例PINP血清样本，用本文建立的方法和罗氏诊断公司的PINP检测方法同时对血清进行测试，两种检测方法各重复测定3次，计算血清浓度的平均值。以罗氏参比试剂检测结果为X轴，本文检测结果为Y轴，进行回归分析。

PINP-α1链基因原核表达载体PINP-pXMJ19转化谷氨酸棒状杆菌后，经过IPTG诱导，得到了良好的分泌表达，蛋白条带大约为28 kDa (图 1)，符合预期。经过柱层析纯化，纯度达到95%以上。由表 1可知，通过罗氏电化学发光检测系统测定，纯化后的重组蛋白在稀释10 000倍后仍能与试剂盒中的抗体反应，说明重组蛋白有较好的抗原反应性。

PINP-α1链抗原免疫小鼠7周后，检测其尾血效价达到标准后进行细胞融合。共筛选到3株融合杂交瘤细胞阳性信号较强，且分泌稳定，分别命名为8C12、2B10、1F11，取阳性杂交瘤细胞悬浮液注射入小鼠腹腔，常规方法制备腹水抗体，以Protein G柱纯化抗体。通过BCA蛋白浓度检测试剂盒测定，8C12浓度为5.07 mg/ml，2B10浓度为6.92 mg/ml，1F11浓度为6.84 mg/ml。通过Western blotting鉴定抗体的结合特异性，以纯化的PINP-α1链蛋白为样品，分别用3株单抗与其结合。结果如图 2所示，3株单抗均可与PINP-α1链蛋白反应，表明制备的PINP-α1链单抗特异性较好。以2个不同浓度的抗原P6和P3为样本，对3株抗体进行配对筛选。结果如图 3所示，当P6的OD450值越高，且P6/P3的比值越大时，样本间有更宽的信号空间。在后续的标准曲线建立以及血清测定中，抗体识别不同浓度样本所产生的信号空间同样更宽泛，分辨能力更强。故选择组合2，即将8C12作为捕获抗体、1F11作为检测抗体用于后续检测方法的建立。

当捕获抗体达到3 μg/mL后，信号值基本处于平稳状态，因此选择3 μg/mL作为捕获抗体的工作浓度。并且由图 4可知，当检测抗体为3 μg/mL信号值最大，故选择3 μg/mL作为检测抗体的工作浓度。

如图 5所示，当孵育时间为30 min时，样本信号值已基本达到饱和，因此将孵育时间确定为30 min。

将配制好的6个不同浓度(1 200、600、300、50、10、0 ng/mL) 的标准品分别重复测定3次，得到1组浓度值与信号值数据，建立的四参数Logistic方程相关为Y=34 662.724 7+ (64 899 948.669 7-34 662.724 7)/(1+(X/4 508.913 2) (–1.072 6))，R2=0.993 8，将x+2s对应的信号值423 51代入标准曲线中，计算得到浓度值为1.22 ng/mL。即本方法最低检测限为1.22 ng/mL。

对高、低浓度2个样本的检测数据进行分析，结果如表 2所示，3个批次内的变异系数和批次间的变异系数均小于10%。

结果如表 3所示，在4.49–1 150.45 ng/mL之间，样本理论浓度和实际浓度间的线性关系良好，拟合后线性回归方程(图 6) 为Y=0.943 6X+6.434 1，R2大于0.990，并且相对偏差均在±10%以内，故将本方法的线性范围定为5–1 100 ng/mL。

经计算，3个不同浓度水平的检测样本回收率分别为107%、105%、93%，均在允许的误差(100±15)%以内，满足要求。

用本方法与罗氏PINP检测系统检测临床血清160份。经分析计算，相关系数R2=0.906 2，两种检测方法有良好的一致性(图 7)。

骨代谢生化标志物可以反映骨代谢状态，是协助骨质疏松等疾病鉴别诊断、治疗效果评价的关键指标[12-13]。近年来，对于骨代谢标志物的检测发展迅速，临床应用日益广泛。常见的骨代谢标志物包括骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OC)、Ⅰ型胶原N端交联端肽(NTX-I)、破骨细胞抑制因子(OGP)、尿脱氧吡啶校正肌酐(DPD)等。这些标志物虽能够反映骨骼吸收与骨形成的动态变化，对骨骼相关疾病的预防和诊断鉴别有一定的参考价值，但它们各自有优点和缺陷，会受到一些临床变化因素的干扰，例如年龄、性别、节律变化和饮食等因素的影响[4, 14]，因此这些不同的骨代谢标志物存在变异性，导致其临床价值不能够统一。PINP是一种新型骨代谢标志物，在机体内稳定存在，不会受到激素、食物和昼夜节律等干扰因素的影响，避免了其他标志物的缺点。研究表明，骨代谢疾病经药物治疗一段时间后，机体PINP浓度变化速率是上述其他几种标志物的5倍以上[14]，说明PINP比以往常用的标志物更加灵敏和特异地反映了骨骼的生长变化。因此PINP不仅可以快速、特异地反映机体骨骼重建的变化情况，也为评价骨骼疾病的治疗效果提供了有效的手段。

PINP由两条α1链和一条α2链组成，两条α1链较长，伸展在外侧，使其抗原结构域裸露出来，因此PINP的免疫位点大多数位于α1链[6]。起初，我们试图借鉴前人研究经验[15]，从骨转移癌症患者的胸水中纯化提取天然的PINP多肽抗原，但这种方法需使用胶原酶，目标蛋白很容易被降解；另外考虑到后续检测方法的建立需要大量的多肽抗原作为标准品，因此需要稳定可行的抗原获得途径。谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum是生产氨基酸的重要工业微生物[16]，近年来逐渐用于蛋白表达。虽然这一新兴的表达系统仍处于初步阶段，但谷氨酸棒杆菌独有的特性依然引起了研究者的兴趣。例如，与细胞相比培养成本低、生长迅速；与大肠杆菌等原核表达系统相比无内毒素、胞外蛋白酶活性低、分泌能力强[17]。目前，谷氨酸棒状杆菌已成功应用于单链可变片段(scFv)[18]和N-末端脑利钠肽(NT-proBNP)[19]等多种医用蛋白的表达。我们依托本实验室成熟的谷氨酸棒状杆菌表达系统，首次利用谷氨酸棒状杆菌表达了PINP-α1链多肽，通过添加内源信号肽cspB，使目标产物分泌到细胞上清中，最终获得了高纯度的目标蛋白，以其为抗原制备抗体，建立了定量检测PINP的化学发光免疫分析法。

目前世界范围内只有罗氏诊断和Orion诊断两家公司提供商用PINP检测试剂盒。有文章报道[20]，Orion诊断试剂检测的是血清中PINP三聚体的浓度，罗氏诊断试剂不仅能检测PINP三聚体，还可以检测体内少量游离的PINP-α1链，并且二者结果高度相关，都能准确检测人体内PINP的含量。我们从无锡市人民医院收集了160例临床血清样本，与罗氏公司的PINP检测试剂盒进行方法学比对，结果表明两种方法的相关系数R2大于0.90，达到了体外诊断试剂的相关要求，并且本方法的准确度、精密度、线性、检测限等性能指标均达到了商用试剂盒的标准。但当样本浓度大于500 ng/mL时，本方法的检测结果与罗氏诊断的结果产生离散情况，可能是抗体的分辨能力存在差异或是抗体试剂的缓冲体系需要继续优化。我们接下来尝试改变抗体稀释液的成分，通过添加抗体阻断剂、聚乙二醇(PEG) 等中性大分子和表面活性剂以减少免疫反应的非特异性吸附，从而提高检测结果的准确性。另外手工实验影响因素较多，容易使实验结果的一致性产生差异，因此后续计划将本文建立的检测方法适配到一种全自动化学发光检测仪并进一步优化检测程序，提高检测方法的稳定性。将本方法应用到骨代谢疾病筛查，具有很高的社会经济价值。