普鲁兰多糖生物合成的关键影响因素及其机理研究

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作者：

盛龙

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摘要：

普鲁兰多糖是由出芽短梗霉产生的一种线性胞外多糖,它主要由重复单位麦芽三糖通过α-(1-6)糖苷键连接而成.独特的化学结构赋予了其优良的性质,如高水溶性,成膜性,阻氧性,可塑性,低粘度和易于生物降解的理化性质.因而普鲁兰多糖广泛的应用于食品和医药等工业中.出芽短梗霉合成普鲁兰多糖是一个复杂的生理代谢过程,并且受到外界环境的影响很大.为了解普鲁兰多糖的生物合成机理,本论文研究了普鲁兰多糖合成的糖代谢途径以及氮源调控出芽短梗霉代谢过程的蛋白质组学,同时探讨了表面活性剂提高普鲁兰多糖产量的机理,基于出芽短梗霉细胞生理代谢特性进行发酵调控,最后利用两阶段培养技术与策略对普鲁兰多糖发酵过程进行优化控制. 不同的碳源中,蔗糖作为底物时相比其它碳源底物得到的普鲁兰多糖产量高,发酵液中蔗糖并不是简单的分解成果糖和葡萄糖,而是由出芽短梗霉分泌β-呋喃果糖苷酶生成蔗果三糖,从而降低发酵液环境对细胞的渗透压,而后蔗果三糖再次被分解作为碳源利用.出芽短梗霉产生的β-呋喃果糖苷酶是一种诱导性酶,受到碳源的影响.培养基中存在蔗糖时,酶的产量最高.出芽短梗霉细胞破碎液中并没有检测到ED途径中关键酶2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶的酶活,而具有EMP途径和HMP途径的关键酶磷酸果糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性,因而出芽短梗霉中心代谢途径由EMP途径,HMP途径,TCA循环构成,并不存在ED途径.碘乙酸会抑制EMP途径导致HMP途径通量的增加,造成普鲁兰多糖产量的降低.低浓度的碘乙酸会促进菌体的生长,但高浓度的碘乙酸会抑制菌体生长. 过多的氮源使碳通量流向生物量,氮源的消耗意味着出芽短梗霉发酵产生更多胞外多糖.低氮浓度(0.6g/L的硫酸铵)更适宜普鲁兰多糖的合成.首次建立出芽短梗霉的二维图谱,提取其全细胞蛋白用于蛋白质组的分析.通过ImageMaster软件分析,大约有1100个可视化的蛋白点.在MALDI-TOF/TOF分析的19个差异值最大的蛋白点,与真菌物种和其它微生物的已知蛋白进行匹配,共有12个蛋白被成功鉴定,达到63%的鉴定率.12个成功鉴定的蛋白中,氮源限制的样品有7个下调和5个上调.下调的鉴定蛋白包括初生关联多肽复合体β亚组,过氧化物氧化还原酶-6,α-葡聚糖分支酶,二磷酸果糖醛缩酶,精氨酸酶,烯醇酶,假设蛋白ARB_01037.相较之下,上调的鉴定蛋白包括氰酸酯水合酶,线粒体过氧化物氧化还原酶-1,假设蛋白SMAC_07435,ATP合酶β亚组,热休克蛋白70.这些蛋白涉及到能量代谢,抗氧化,氨基酸合成代谢,糖原合成,糖酵解,蛋白运输和转录调控. 不同类型的表面活性剂中,吐温80对促进合成普鲁兰多糖效果最好.在吐温80添加浓度为5g/L时,摇瓶中普鲁兰产量较空白对照组提高24.60%.在5L发酵罐中,添加5g/L吐温80,其产量达到最高55.37g/L,较空白对照组提高达45.12%,且对出芽短梗霉的细胞生长几乎没有影响.故此表面活性剂可作为提高出芽短梗霉产普鲁兰多糖产量的最佳表面活性剂.吐温80的添加通过提高出芽短梗霉细胞脂肪酸组成中不饱和脂肪酸含量从而影响了细胞膜的通透性,使得普鲁兰分子更易分泌到胞外,同时在普鲁兰多糖生物合成中起着关键作用的葡萄糖糖基转移酶的酶活也有相应的提高.吐温80的添加会降低普鲁兰多糖分子量的大小,这表明吐温80确实影响到了普鲁兰从胞内向胞外的分泌过程. 研究了不同核苷酸碱基对出芽短梗霉发酵的影响,尿嘧啶的添加对普鲁兰多糖的产量有明显促进的作用,然而添加的时间非常重要.尿嘧啶的添加时间越早,出芽短梗霉的生物量就越高,48h添加,普鲁兰多糖产量最高.出芽短梗霉细胞的UDPG含量随着发酵过程先降低后增加,在48h时含量最低,而此时普鲁兰合成速率最快.尿嘧啶核苷磷酸化酶随着尿嘧啶的添加,酶活增高.通过考察发酵过程中常见的17种游离氨基酸的代谢动力学,选取丝氨酸,半胱氨酸,甲硫氨酸,苏氨酸,酪氨酸和赖氨酸添加到培养基中,发现丝氨酸明显提高普鲁兰多糖产量. 出芽短梗霉细胞生长最好时的温度与普鲁兰多糖产量最高时的温度是不一致的.两阶段温度培养要优于恒温培养模式.出芽短梗霉细胞生长最好时的pH与普鲁兰多糖产量最高时的pH是不一致的.两阶段pH培养要优于恒定pH培养模式.不同pH培养下的发酵液最终pH比初始pH都要低.尽管细胞外的pH从pH1.5升高到pH9.5,细胞内pH略有增加,但维持在一个相对稳定的范围,pH5.7±0.7.两阶段控制温度pH对出芽短梗霉发酵的普鲁兰多糖产量达到47.83g/L,比恒定温度和pH培养发酵的产量高出27.45%,且发酵时间缩短了12h.同时蔗糖的利用率,普鲁兰多糖的转化率和生产率都大大的提高了.

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关键词：

普鲁兰多糖 出芽短梗霉 合成机理

学位级别：

博士

学位年度：

2015

被引量：

4