普通PCR常见问题总结

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：

1、将PCR反应的试管与反应板紧贴。

2、当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

3、不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。

4、对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。

没有扩增产物：

1、在提供MgCl 2 缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl 2 浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

2、泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl 2 ，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg 2+ 。

3、检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。

4、检查模板和引物的用量。

5、增加循环次数和/或模板DNA的用量。

泳道中出现模糊条带：

1、减少循环次数或模板DNA的用量。

2、提高退火温度，但不要超过68℃。

3、重新设计引物或设计更长的引物。

其他值得注意的条件：

1、建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。

2、最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。

3、大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。

4、优化Mg2+的浓度是必需的。

5、基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。

6、要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。

7、降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

8、变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。

9、延伸：68--72℃下进行延伸操作。

10、循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。

11、长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。

12、测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

引物设计：

1、一般长度20-30bp；

2、至少50%的GC含量；

3、避免引物二聚体和二级结构；

4、引物对的Tm值应该接近。