p53蛋白在细胞凋亡中的作用机制研究

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作者：

杜文静

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摘要：

Bad(Bcl-2 antagonist of cell death)是Bcl-2蛋白家族的成员之一,是细胞凋亡的正调控因子,正常情况下定位于细胞质中.像其它的BH3-only蛋白一样,使结合在Bcl-2或者Bcl-xl上的Bax游离下来从而促进凋亡.Bad的凋亡活性通过它的Ser112,Ser136和Ser155三点的磷酸化来调控.在没有外界压力的细胞中,Bad被几个蛋白激酶如蛋白激酶A(PKA)或者蛋白激酶B(AKT)磷酸化,从而与14-3-3结合.但是,当细胞受到凋亡刺激时,Bad被迅速地去磷酸化并且迁移到线粒体上,从而诱导细胞凋亡. 肿瘤抑制因子p53在不同的刺激下分别调节细胞周期或者细胞凋亡.它可以转录活化许多靶基因,如p21,Bax,p53DINP1,Bid,Puma等等.但是,还有研究证明p53也通过转录非依赖的形式来调节细胞凋亡,尽管这个作用的机制还没有被详细的阐明,但是最近的研究报道说明了,p53可以直接转移定位到线粒体上,与Bcl-2或者Bcl-xl结合后,从而使Bax游离下来并活化.同样,p53还可以通过打断Bak/Mcl-1或者Bak/Bcl-2之间的结合来诱导细胞凋亡. 尽管Bcl-2家族中的许多分子,例如Puma,Noxa,Bax和Bid,都可以被p53转录调控,这些已经被报道并且研究的很透彻,但是Bad与p53之间的关系至今仍没有被报道和研究.这里,我们报道了p53可以结合在Bad基因起始密码子上游的大约6.6kb的区域,转录活化Bad的表达.我们还阐明了Bad可以和细胞质中的p53结合,从而阻止了p53的进核,导致了p53对于Bad转录活性的降低.另外,Bad可以介导p53定位于线粒体上,并且在线粒体上形成Bad/p53的复合物.两个系列的证据说明了此结论:其一,当我们利用从H1299细胞中纯化的线粒体和纯化的p53蛋白,野生型的Bad或者突变体的Bad(这个突变体仍然可以结合p53,但是不能定位于线粒体上)蛋白质共同孵育时,p53只可以被野生型的Bad蛋白介导定位于线粒体上,而不能被突变体的Bad介导并定位到线粒体上;其二,利用小RNA干扰的实验,降低细胞内Bad的蛋白水平时,同时也减少了p53在线粒体上的定位.在线粒体上形成的Bad/p53复合物通过诱导Bak的活化和寡聚化从而诱导了细胞凋亡.通过小RNA干扰试验减少Bad的表达水平明显的降低了etoposide(鬼臼毒素)诱导的细胞凋亡.从而,我们的实验数据首次证明了Bad在p53转录依赖的和非依赖的通路中扮演了双重的角色. 总之,我们发现了Bad基因上游6.6kb处的p53的结合作用区域,并且可以被p53转录活化:Bad通过与p53结合,一方面抑制了p53的进核,控制了细胞核内p53的量,从而使细胞内Bad的蛋白水平处于平衡,另一方面,Bad通过介导p53定位于线粒体上从而促进了p53诱导的细胞凋亡. Siva1是CD27结合的蛋白,在细胞凋亡的内在途径和外在途径中均起着重要的作用.过量表达Siva1可以结合BCl-xl,并抑制Bcl-xl介导的对于uv诱导细胞凋亡的防护.Siva1和它的剪切突变体Siva2在T淋巴细胞中都可以介导caspase依赖的线粒体途经的细胞凋亡.据报道,Siva1包含在TCR介导的细胞凋亡过程中.Jacobs SBR等人报道,Siva1对于神经元细胞中p53依赖的凋亡是重要的.总之,这些报道都是关于Siva1在凋亡刺激的情况下,它的促凋亡能力,但是,在没有外加压力的情况下,Siva1和Siva2在细胞中起着怎样的功能一直没有报道. 肿瘤抑制因子p53,在细胞周期,细胞凋亡和基因组的稳定性等的多个方面中起着关键的调节作用.它可以转录活化很多的靶基因,如p21waf1,Bax,Bad,Hmd2和Siva等等.其中一些靶蛋白如Hdm2和Bad等可以结合p53,从而形成了负反馈来调节p53.在正常情况下,p53的蛋白水平被严格地控制着,通过许多的调控因子进行严格的调节,其中最关键的是Hdm2.Hdm2所介导的p53的泛素化降解又可以被细胞内的很多分子进一步更加精确的调节,如PCAT和Daxx等.PACT可以直接与Hdm2结合,增加了Hdm2与p53之间结合的能力,从而增加了p53的泛素化降解.与此相近的是,Daxx通过结合Hausp来稳定了Hdm2,从而增加了Hdm2对于p53的降解活性,进一步增加了p53的泛素化降解.此外,p53还可以影响细胞的迁移和肿瘤的发生.据文章报道,在没有外界压力的情况下,p53可以促进细胞迁移,而缺乏p53的细胞其迁移能力减弱.然而,也有文章报道,Gadea G等报道p53的缺失可以促进RhoA-ROCK依赖的细胞迁移. 当细胞受到外界压力时,肿瘤抑制因子p53诱导很强的抗存活能力,p53的这种能力在正常的细胞中被限制,主要是由于被Hdm2所介导的迅速泛素化和降解.p53诱导Hdm2蛋白的表达,从而两者之间建立了负反馈调控机制.p53-Hdm2二者之间相互作用的调控机制以及其他的哪些蛋白也存在于p53的这种负反馈抑制中还没有被完全地研究.在本章中,我们主要展示了在没有外界压力的细胞中,p53-Hdm2的相互作用被Siva1蛋白所加强.Siva1蛋白,与Hdm2相类似的是,它也是p53靶基因的产物.Siva1既可以与p53结合,也可以与Hdm2结合,与二者结合的区域是不同的,从而加强了Hdm2介导的p53的泛素化和降解.此外,Siva1抑制了p53所介导的基因表达,细胞凋亡和细胞的迁移.Siva1的功能可能与它自身可以形成同源二聚体有关,因为Siva1的一个剪切突变体Siva2,它不能形成二聚体而且丧失了降解p53的功能.在小鼠成瘤试验中,过量表达的Siva1可以抑制p53介导的肿瘤抑制功能,而下调Siva1的表达则增加了p53的这种功能.当DNA受到损伤时,Siva1与p53之间和Siva1与Hdm2之间的结合被减弱.这些结果证明了Siva1作为一个重要的接头分子促进了Hdm2介导的p53降解. 综上所述,当细胞受到外界压力时,Siva1将作为抑制p53活性的负反馈的一部分.

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关键词：

p53蛋白 细胞凋亡 细胞周期 蛋白激酶 肿瘤抑制因子

学位级别：

博士

学位年度：

2008

DOI：

10.7666/d.y1270788

被引量：

10