动物组织、临床组织及活检样本的长期冻存及复苏方法与流程

1.本发明属于动物细胞冻存技术领域，特别是动物组织、临床组织及活检样本的长期冻存及复苏方法。

背景技术：

2.动物组织、临床组织及活检样本的冻存，是将新鲜组织通过清洗、修剪后，置于冻存液中，再将其转入液氮中长期保存的方法。动物组织、临床组织及活检样本的复苏，是将冻存管中的冻存有组织经过特殊的处理方法，重新获得具有活性的组织细胞。3.目前，许多动物组织经过现有的冻存和复苏技术，复苏获得的组织细胞活性相比冻存之前出现明显下降，无法稳定传代，甚至完全无法传代。并且，大多数冻存和复苏技术都只针对某一种特定的动物细胞，对于不同的动物组织和细胞，往往需要采用不同的冻存和复苏技术。4.例如，中国专利申请cn108739795a提供的一种脂肪干细胞冻存液及其冻存方法，或者中国授权专利cn107173382a提供的猪胎儿成纤维细胞冻存液，这些都是针对的脂肪干细胞或猪胎儿成纤维细胞。更重要的是，这些冻存和复苏技术，有的最佳保护期仅约30天，超过则复苏细胞的完整性将显著下降；有的经过复苏细胞的活性都不能100％恢复，不能长期有效地传代。

技术实现要素：

5.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种动物组织、临床组织及活检样本的长期冻存及复苏方法，具体通过以下技术实现。6.动物组织、临床组织及活检样本的长期冻存及复苏方法，包含长期冻存方法和相应的复苏方法；长期冻存方法为：7.s1、取新鲜的动物组织、临床组织或活检组织进行清洗、修剪，剪至糜状；加入体积至少为组织体积3倍的冻存液，混匀获得糜状组织悬液；所述冻存液包括10-40wt％fbs、5-15wt％dmso、0.1-10wt％蔗糖、0.1-10wt％海藻糖、30-70wt％原代细胞完全培养基；8.s2、将糜状组织悬液进行分装，-80℃程序降温，最后转入液氮中完成冻存；9.冻存组织的复苏方法为：10.p1、取冻存组织在37℃水浴至完全融化，用复苏液漂洗1次，低速离心收集组织沉淀；然后用消化液消化，过滤收集细胞悬液，离心收集细胞沉淀；加入红细胞裂解液，室温下轻柔上下颠倒混合裂解，离心收集细胞沉淀；加入5ml的1×pbs，ph值7.2-7.4，用复苏液漂洗1次，再次离心收集细胞沉淀；11.p2、用所述原代细胞完全培养基重悬步骤p1所得细胞沉淀，接种于细胞培养瓶中进行培养，即完成冻存组织复苏。12.优选地，所述原代细胞基础培养基中含有dmem/f12培养基添加1×n2、1mm丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5μg/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、100μg/ml肝素、5ng/ml孕酮及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b，还含有1nm与动物组织、临床组织或活检组织专门对应的复合生长因子。针对不同种类和部位的动物组织，所用的复合生长因子也有所不同，例如当对人高级别胶质瘤原代细胞进行冻存时，所用的复合生长因子可以参考申请人于2020年09约08日授权公告中公开的10ng/ml人成纤维细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；又例如当对前列腺腺癌组织或狗阴茎癌组织进行冻存时，所用的复合生长因子可以是1nm人工合成雄性激素。上述这些复合生长因子可以直接采购自赛默飞世尔公司。13.优选地，冻存组织的复苏方法中，所述复苏液为：所述复苏液为：dmem培养基添加5x非必需氨基酸、20mm还原剂谷胱甘肽、0.21ug/ml脂肪亚油酸甲酯、20mm l-丙氨酰-l-谷氨酰胺、25ug/ml转铁蛋白、25ng/ml孕酮，以及5nm与动物组织、临床组织或活检组织专门对应的复合生长因子。14.优选地，冻存组织的复苏方法中，步骤p1的所述消化液为含有1x i型胶原酶、0.25％胰酶-0.2％edta。15.优选地，冻存组织的复苏方法中，步骤p1-p2的离心条件为800-1000rm，4-10min。16.优选地，冻存组织的复苏方法中，步骤p2的在细胞培养瓶中的培养条件为37℃，5％co2。17.与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供的上述方法，针对不同种类的动物组织细胞均能实现非常好的冻存和复苏效果；经过最多长达近两年的冻存，复苏后提取的细胞仍具有非常好的活力及传代活性。附图说明18.图1为实施例1的人高级别胶质瘤原代分离的原代细胞的细胞形态图，放大倍数100；19.图2为实施例1的人高级别胶质瘤组织冻存一年半后分离的原代细胞的细胞形态图，放大倍数：100；20.图3为实施例1的人高级胶质瘤原代细胞g02-3和g02-5的生长曲线图；21.图4为实施例2的人前列腺癌原代分离的原代细胞的细胞形态图，放大倍数：100；22.图5为实施例2的人前列腺癌组织冻存二十二个月后分离的原代细胞的细胞形态图，放大倍数：100；23.图6为实施例2的人前列腺腺癌原代细胞pc01和pc01-2的生长曲线图；24.图7为实施例3的狗阴茎癌原代细胞的细胞形态图，放大倍数100；25.图8为实施例3的狗阴茎癌组织冻存两个月后分离的原代细胞的细胞形态图，放大倍数：100；26.图9为实施例3的狗阴茎癌原代细胞ctvt01和ctvt01-2的生长曲线图。具体实施方式27.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件进行，或按照制造厂商所建议的条件，所述的室温为26℃，本发明所用的原料或试剂除特别说明外，均市售可得。28.实施例1：人高级别胶质瘤原代细胞的原代分离培养、冻存、复苏，复苏原代细胞的分离培养和传代培养29.1、人高级别胶质瘤原代细胞的原代分离培养30.(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉协和医院获得新鲜的临床胶质瘤切除标本，该标本为whoiv级，胶质母细胞瘤。31.(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000u/ml青霉素、1000μg/ml硫酸链霉素、2.5μg/ml两性霉素和50μg/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离。32.(3)原代分离培养：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1xpbs(ph7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状；加入20ml含1×i型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％edta的消化液消化肿瘤组织，消化时间为1.5h，并用100μm滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4min，离心后收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(solarbio，r1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入5ml的1×pbs(ph值7.2-7.4)，1000rpm，4分钟，离心收集细胞沉淀；用df31完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％co2条件下进行培养；33.df31完全培养基的组成成分为：dmem/f12培养基添加1×n2、1mm丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5μg/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、10ng/ml人成纤维细胞生长因子、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、100μg/ml肝素、5ng/ml孕酮及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b；以下实施例1中所用的df31培养基成分均与此相同。34.按照上述方法分离培养成功的人胶质瘤原代细胞，显微镜下观察细胞形态如图1所示，细胞呈梭形，有不规则分支或分叉。细胞分类命名为人高级别胶质瘤原代细胞xhhg-02，已于2018年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no：c2018215。上述人胶质瘤原代细胞即g02-3。35.2、人高级别胶质瘤组织的冻存36.(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉协和医院获得新鲜的临床胶质瘤切除标本，该标本为whoiv级，胶质母细胞瘤，与实施例1为同一临床组织。37.(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000u/ml青霉素、1000μg/ml硫酸链霉素、2.5μg/ml两性霉素和50μg/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离；38.(3)组织冻存：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1×pbs(ph值7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状。加入3倍于组织体积的专用胶质瘤组织冻存液，混匀，每管1ml分装入冻存管，经程序降温后转入液氮长期保存；其中胶质瘤组织冻存液为：50％fbs、10％dmso、5％蔗糖、5％海藻糖、30％df31完全培养基。39.3、冻存一年半的人高级别胶质瘤组织的复苏及分离培养40.从液氮中取出含人高级别胶质瘤冻存组织(即实施例2的冻存组织)的冻存管，37℃水浴快速完全融化；完全融化(大约1min)后用10ml复苏液漂洗一次，低速离心收集组织沉淀，加入20ml含1×i型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％edta的消化液消化肿瘤组织，消化时间为1.5h，并用100μm滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4分钟，离心后收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(solarbio，r1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入5ml的1×pbs(ph值7.2-7.4)，1000rpm，4min，离心收集细胞沉淀；用df31完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％co2条件下进行培养。41.按照上述方法分离培养成功的人胶质瘤原代细胞，显微镜下观察细胞形态如图2所示，细胞呈梭形或纤维状，不规则分支或分叉。细胞分类命名为人高级别胶质瘤原代细胞，即g02-5。42.4、复苏的人胶质瘤原代细胞的传代培养43.(1)培养于t25培养瓶的细胞丰度达到80％时，用1×pbs(ph值7.2-7.4)漂洗细胞2次，加入1ml 0.05％胰酶-edta消化单层细胞2-3min。44.(2)加入2ml df31完全培养基终止消化。45.(3)1000rpm离心4min，去上清，收集细胞悬液，用1ml df31完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入t25培养瓶中进行培养。46.按照上述方法传代培养的人高级别胶质瘤原代细胞g02-3和g02-5，连续传代约50天。本发明的经一年半冻存人胶质瘤组织提取的原代细胞仍能保持增殖状态正常生长,培养建立的细胞生长曲线如图3所示。47.实施例2：人前列腺癌腺癌原代细胞的原代分离培养、冻存、复苏，复苏原代细胞的分离培养和传代培养48.1、人前列腺癌腺癌原代细胞的原代分离培养49.(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉同济医院获得新鲜的临床前列腺癌切除标本，该标本为前列腺腺癌(gleason评分4+4＝8)。50.(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000u/ml青霉素、1000μg/ml硫酸链霉素、2.5μg/ml两性霉素和50μg/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离。51.(3)原代分离培养：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1×pbs(ph值7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状。加入20ml含1×i型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％edta的消化液消化肿瘤组织，消化时间为2.5小时，并用100μm滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4分钟，离心后收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(solarbio，r1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入5ml的1×pbs(ph值7.2-7.4)，1000rpm，4分钟，离心收集细胞沉淀；用df41完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％co2条件下进行培养；52.df41完全培养基的组成成分为：dmem/f12培养基添加1×n2、1mm丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5μg/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、1nm人工合成雄性激素、100μg/ml肝素、5ng/ml孕酮及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b；以下实施例中的df41培养基成分均与此相同。53.按照上述方法分离培养成功的人前列腺腺癌原代细胞，显微镜下观察细胞形态如图4所示，细胞呈梭形，不规则分支或分叉。细胞分类命名为人前列腺腺癌原代细胞tjpc-01，已于2021年11月03日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctcc no：c2021287。上述人前列腺腺癌原代细胞即pc01。54.2、人前列腺癌腺癌组织的冻存55.(1)通过医院伦理委员会，经患者或患者监护人同意且签订知情同意书后，从武汉同济医院获得新鲜的前列腺腺癌切除标本，该标本为前列腺腺癌(gleason评分4+4＝8)与实施例8为同一临床组织。56.(2)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000u/ml青霉素、1000μg/ml硫酸链霉素、2.5μg/ml两性霉素和50μg/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离；57.(3)组织冻存：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1×pbs(ph值7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状。加入3倍于组织体积的专用前列腺癌组织冻存液，混匀每管1ml分装入冻存管，经程序降温后转入液氮长期保存。其中前列腺癌组织冻存液为：10％fbs、5％dmso、5％蔗糖、10％海藻糖、70％df41完全培养基。58.3、冻存二十二个月的人前列腺癌腺癌组织的复苏及分离培养59.从液氮种取出含人前列腺腺癌冻存组织的冻存管，37℃水浴快速融化；完全融化后用10ml复苏液漂洗一次，低速离心收集组织沉淀，加入20ml含1×i型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％edta的消化液消化肿瘤组织，消化时间为2.5h；并用10μm滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4分钟，离心后收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(solarbio，r1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入用10ml复苏液漂洗一次，1000rpm，4min，离心收集细胞沉淀；用df41完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％co2条件下进行培养。60.按照上述方法分离培养成功的人前列腺腺癌原代细胞pc01-2，显微镜下观察细胞形态如图5所示。61.4、复苏的人前列腺癌腺癌原代细胞的传代培养62.(1)培养于t25培养瓶的细胞丰度达到80％时，用1×pbs(ph值7.2-7.4)漂洗细胞2次，加入1ml 0.1％胰酶-edta消化单层细胞5min。63.(2)加入2ml df41完全培养基终止消化。64.(3)1000rpm离心4min，去上清，收集细胞悬液，用1ml df41完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入t25培养瓶中进行培养。65.按照上述方法传代培养的人高级别胶质瘤原代细胞pc01和pc01-2，连续传代约40天；本发明的经二十二个月冻存的人前列腺腺癌组织提取的原代细胞仍能保持增殖状态正常生长，培养建立的细胞生长曲线如图6所示。66.实施例3：狗阴茎癌原代细胞的原代分离培养、冻存、复苏，复苏原代细胞的分离培养和传代培养67.1、狗阴茎癌原代细胞的原代分离培养68.(1)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000u/ml青霉素、1000μg/ml硫酸链霉素、2.5μg/ml两性霉素和50μg/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离。69.(2)原代分离培养：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1×pbs(ph值7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状；加入20ml含1×i型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％edta的消化液消化肿瘤组织，消化时间为2.5h，并用100μm滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4min，离心后收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(solarbio，r1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入5ml的1×pbs(ph值7.2-7.4)，1000rpm，4min，离心收集细胞沉淀。用df41完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％co2条件下进行培养；70.df41完全培养基：dmem/f12培养基添加1×n2、1mm丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、10ng/ml硒酸钠、5μg/ml转铁蛋白、10ng/ml人表皮生长因子、1nm人工合成雄性激素、100μg/ml肝素、5ng/ml孕酮及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素b；以下实施例中的df41培养基成分均与此相同。71.按照上述方法分离培养成功的狗阴茎癌原代细胞命名为ctvt01，显微镜下观察细胞形态如图7所示。72.2、狗阴茎癌组织的冻存73.(1)切除标本立即放入含预冷无菌的组织保存液(含1000u/ml青霉素、1000μg/ml硫酸链霉素、2.5μg/ml两性霉素和50μg/ml的庆大霉素)的收集管中，并立即放入4℃样本运输箱中，于4h内运输至实验室进行细胞分离；74.(2)组织冻存：获取组织在生物安全柜中，用无水乙醇迅速冲洗1次，用1×pbs(ph值7.2-7.4)迅速冲洗2次，用解剖镊子在显微镜下去除血管、脂肪及坏死组织部分，用解剖剪刀将组织剪至糜状；加入3倍于组织体积的专用前列腺癌组织冻存液，混匀每管1ml分装入冻存管，经程序降温后转入液氮长期保存。其中狗阴茎癌组织冻存液为：10％fbs、5％dmso、5％蔗糖、10％海藻糖、70％df41完全培养基，与实施例2的人前列腺癌腺癌原代细胞的冻存液配方完全相同。75.3、冻存二个月的狗阴茎癌组织的复苏及分离培养76.从液氮种取出含前列腺腺癌冻存组织的冻存管，37℃水浴快速融化；完全融化后用10ml复苏液漂洗一次，低速离心收集组织沉淀，加入20ml含1×i型胶原酶和0.25％胰酶-0.2％edta的消化液消化肿瘤组织，消化时间为2.5h，并用100μm滤膜过滤收集细胞沉淀，1000rpm，4分钟，离心后收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入10ml红细胞裂解液(solarbio，r1010)，室温裂解5min后离心收集细胞沉淀；向细胞沉淀中加入10ml复苏液漂洗一次，1000rpm，4min，离心收集细胞沉淀。用df41完全培养基重悬细胞沉淀，放入细胞培养瓶，于37℃，5％co2条件下进行培养。77.按照上述方法分离培养成功的狗阴茎癌原代细胞ctvt01-2，显微镜下观察细胞形态如图8所示。78.4、复苏的狗阴茎癌原代细胞的传代培养79.(1)培养于t25培养瓶的细胞丰度达到80％时，用1×pbs(ph值7.2-7.4)漂洗细胞2次，加入1ml 0.1％胰酶-edta消化单层细胞5min。80.(2)加入2ml df41完全培养基终止消化。81.(3)1000rpm离心4min，去上清，收集细胞悬液，用1ml df41完全培养基重悬后补足培养基，按照1传2的比例，放入t25培养瓶中进行培养。82.按照上述方法传代培养的狗阴茎瘤原代细胞ctvt01和ctvt01-2，连续传代约40天，本发明的经二个月冻存的狗阴茎癌组织提取的原代细胞仍能保持增殖状态正常生长，培养建立的细胞生长曲线如图9所示。83.从上述实施例和附图可以看到，采用本发明的冻存方法，在长期冻存(目前最长22个月)后的各类动物组织，在复苏后仍然具有非常好的细胞传代活性，可见本技术提供的冻存和复苏方法对各类动物组织细胞具有非常好的冻存和复苏效果。