肺血管内皮钙黏蛋白在急性肺损伤血管内皮屏障中的作用及机制

急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是指患者在脓毒症、有害气体吸入、放化疗、创伤、休克等多种非心源性致病因素作用下，引起肺气体交换功能急剧下降，临床上表现为顽固性低氧血症和呼吸窘迫，进一步发展至严重阶段急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS）[1]。尽管对脓毒症ALI的发病机制不断深入研究，小潮气量机械通气、俯卧位通气、限制性液体复苏等肺保护策略在临床得到广泛应用，但ALI的病死率仍居高不下[2]。多中心的流行病学调查显示，ARDS的整体病死率为35%~46%[3-4]。

炎症和氧化应激（ROS）造成肺泡-毛细血管屏障破坏是造成ALI/ARDS的主要原因，其中毛细血管内皮屏障的破坏是启动步骤[5]。内皮屏障的完整性由粘附连接（adherent junction, AJ）、紧密连接（tight junction, TJ）和缝隙连接（gap junction, GJ）介导。肺血管内皮细胞连接主要是粘附连接，血管内皮钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin, VE-Cadherin）-连环蛋白（catenin）复合体是粘附连接的物质基础[6]。内皮屏障通透性增高有“细胞间（paracellular）”途径和“跨细胞（transcellualr）”途径，肺血管内皮“细胞间”通道开放是通透性增高的主要原因。研究ALI/ARDS中VE-Cadherin的变化及机制对于寻找新的治疗靶点意义重大。

VE-Cadherin（也称为钙黏蛋白-5，CD144）是一种类似拉链式的结构，它由5个胞外结构域、1个跨膜结构域和1个高度保守的胞内尾部结构域组成。VE-Cadherin在细胞表面形成顺式二聚体，依赖Ca2+介导细胞连接。VE-Cadherin胞内尾部结构域与β、γ连环蛋白结合。β和γ连环蛋白通过α连环蛋白作为“桥梁”与纤维状肌动蛋白（F-actin）细胞骨架成分相结合，进而维持细胞粘附的稳定[7]。但也有研究未能发现α连环蛋白和VE-Cadherin复合体及F-actin同时结合，而是进一步通过纽蛋白（vinculin）、α辅肌动蛋白（α-actinin）和EPLIN（epithelial protein lost in neoplasm）等连接蛋白间接地把VE-Cadherin复合体和F-actin连接起来[8]。P120连环蛋白结合在VE-Cadherin尾部的近膜区（juxtamembrane domain，JMD），这个JMD恰是VE-Cadherin发生磷酸化的酪氨酸位点，对于介导VE-Cadherin内吞（internalization）至关重要。γ连环蛋白对于粘附连接的作用尚未阐述清楚，可能通过影响血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶（VE-PTP）的表达参与VEGF诱导的VE-Cadherin磷酸化进而影响内皮细胞通透性[9]。粘附连接通过VE-Cadherin复合体和F-actin的动态“开放”和“关闭”调节细胞间缝隙的形成，利于小分子物质的出入和信号转导。除了经典的VE-Cadherin-catenin复合体，发现越来越多的分子与VE-Cadherin相连，如血管内皮生长因子受体2（VEGFR2），血管内皮蛋白酪氨酸磷酸酶（VE-PTP）等。VE-PTP与VE-Cadherin结合，使VE-Cadherin维持在一个去磷酸化状态，从而增强了粘附功能；当VE-PTP失活，VE-Cadherin酪氨酸位点发生磷酸化，见图 1。

ALI/ARDS是由各种肺外-肺外原因引起的肺的弥漫性炎症，各种炎症细胞、炎症介质和细胞因子通过产生蛋白酶、ROS和激活凝血系统级联反应，直接或间接损伤肺泡-毛细血管内皮屏障。在这病理生理进程中，各种刺激会通过VE-Cadherin的磷酸化、内吞和F-actin重构引起肺血管内皮屏障破坏，增加毛细血管渗漏[10]。

VE-Cadherin胞内区尾部结构域含有9个酪氨酸磷酸位点，其中Y645、Y658、Y685、Y731和Y733参与维持内皮屏障完整性。除此之外，VE-Cadherin的丝氨酸磷酸位点S665参与调节粘附连接组装。VEGF、组胺、缓激肽、血小板活化因子（PAF）和血栓素等均可诱导VE-Cadherin-catenin复合体的磷酸化，造成它们解离，从而增加血管通透性，其中非受体酪氨酸激酶Src发挥重要作用。VEGF是最强的血管通透性诱导因子，其受体VEGFR2与VE-Cadherin相连，VEGF诱导VEGFR2酪氨酸位点磷酸化，VEGFR2的Y951磷酸位点与T细胞特异接头蛋白（TSAd）结合后激活Src，Src直接磷酸化VE-Cadherin，与连环蛋白解离，粘附连接破坏，血管通透性增加[11]。此外，Src可以激活p21活化激酶（p21 activated kinase，PAK），活化的PAK磷酸化VE-Cadherin丝氨酸位点导致其内化，细胞间连接受损[12]。再次，VEGF可以激活黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK），诱导β连环蛋白磷酸化后与VE-Cadherin分离[13]。Dong等[14]应用LPS腹腔注射建立脓毒症小鼠模型，Src活化，ROS增加，激活Rho-ROCK（Rho-associated coiled-coil containing protein kinase）信号通路，VE-Cadherin Y685和658酪氨酸位点和肌球蛋白轻（MLC）磷酸化，粘附连接破坏，血管通透性增加。Liu等[15]研究发现，肺炎衣原体可以激活Src，使VE-Cadherin Y658酪氨酸位点磷酸化，内皮屏障通透性增高，此后促进单核细胞的跨膜迁移。Adam等[16]研究发现，单纯Src诱导的VE-Cadherin酪氨酸位点磷酸化不足以降低内皮屏障功能。更有相反的研究发现，VE-Cadherin Y685酪氨酸磷酸化位点是C端Src激酶（Csk）结合位点，而Csk是Src的负性调节因子，可以通过抑制Src活化降低内皮细胞通透性[17]。

VE-Cadherin的内吞降低了胞外区的粘附连接，从根本上影响内皮屏障通透性，VE-Cadherin的磷酸化是其内吞的前提。VE-Cadherin是一种高度动态的粘附分子，其内体运输被网格蛋白包裹的囊泡严格控制。VE-Cadherin的内吞机制尚未完全阐明，可以肯定这种内吞过程依赖于网格蛋白、衔接蛋白-2（adaptor protein 2，AP-2）及发动蛋白的介导。Gavard和Gutkind[12]详细阐述了VEGF引起VE-Cadherin的胞吞过程及机制。VEGF会激活VEGFR-2-Src-Vav2-Rac-PAK信号通路，催化VE-Cadherin的SVR 665-667丝氨酸位点磷酸化。磷酸化的VE-Cadherin招募β-抑制蛋白（β-arrestin），β-arrestin与网格蛋白和AP-2相互作用，导致VE-Cadherin进入网格蛋白包被小窝，进而完成后续内吞过程。VE-Cadherin Ser 665位点与P120结合位点相连，推测p120与VE-Cadherin的结合和解离会影响VE-Cadherin与β-arrestin的相互作用。在前文已述，Src可以直接激活VE-Cadherin 685和658酪氨酸位点使其磷酸化，VEGF-VEGFR2信号通路可以诱导FAK活化使β-catenin磷酸化，VE-Cadherin与β-catenin分离后加速内吞。VE-Cadherin的胞内区与P120及β-catenin相连，因而这两个连环蛋白影响其内吞过程。研究表明，p120连环蛋白通过与VE-Cadherin直接相连阻断了AP-2与VE-Cadherin的结合位点，抑制了网格蛋白介导的VE-Cadherin的内吞；过表达p120连环蛋白与会抑制VE-Cadherin内吞，同时在VE-Cadherin内吞过程中伴有胞内结构域的蛋白水解过程[18]。P120连环蛋白会通过一种Rho非依赖机制抑制VE-Cadherin内吞[19]。

VE-Cadherin-catenin复合体动态调节细胞结构及信息传递。在不同的生理和病理情况下，VE-Cadherin介导的内皮细胞粘附连接存在两种类型，保证内皮屏障完整性的线性粘附连接（linear AJ），降低屏障完整性的局灶性粘附连接（focal AJ）。稳定的线性粘附连接受周围肌动蛋白束支撑（circumferential actin bundles，CAB）；而血管通透性因子如组胺、缓激肽和PAF等会使F-actin形成应力纤维，内皮细胞异常收缩，这种收缩差产生的拉力作用在VE-Cadherin上，使内皮细胞从线性粘附连接转化为局灶性粘附连接，内皮细胞通透性增加[7]。Rho家族成员的小GTPase如RhoA、Rac和Cdc42在调控内皮细胞肌动球蛋白收缩过程中发挥重要作用，这种作用依赖于不同的细胞背景及刺激因素[20]。血栓素主要通过RhoA信号通路诱导应力纤维形成，增加血管通透性。RhoA-ROCK激活细胞质内非肌肉肌球蛋白Ⅱ（non-muscle myosinⅡ，NMⅡ），诱导肌动球蛋白收缩，使F-actin转化为应力纤维，产生拉力使内皮细胞屏障失稳，VE-Cadherin内吞[7, 21]。VEGF和组胺分别通过Rac和cdc42增加血管通透性。与之相反的是，Ras家族的Rap1可以通过激活Rac和cdc42使肌动蛋白聚合成CAB后形成线性粘附连接，降低血管通透性[22]。刘雪婷等[23]研究发现，RhoA/mDial信号通路通过参与LPS诱导肺微血管内皮细胞表达埃兹蛋白-根蛋白-膜突蛋白（p-ERM），介导应力纤维的形成，进而影响纤维肌动蛋白细胞骨架重排。

VE-Cadherin介导的肺毛细血管内皮细胞粘附连接的“开放”和“关闭”是中性粒细胞进入肺泡的关键。以中性粒细胞为首的炎症细胞会通过粘附连接处迁移至肺泡腔进一步损伤肺泡，形成恶性循环。血管内皮细胞在炎症刺激下表达P-选择素（P-selectin）对白细胞进行捕获，此后在P-selectin、E-selectin作用下开始滚动和缓慢滚动，细胞间粘附分子1（ICAM1）和血管细胞粘附分子1（VCAM1）逮捕白细胞，使白细胞爬行，在VE-Cadherin介导的粘附连接进行跨膜穿越[24]。在炎症过程中，中性粒细胞和内皮细胞各自通过表达不同分子相互作用。中性粒细胞的ROCK活化，调节整合素的迁移和成簇及Mac1表达，肺血管内皮细胞ROCK介导NF-κB移位入核表ICAM-1。在中性粒细胞到达粘附连接处，ROCK介导的肌动蛋白收缩形成应力纤维，促进内皮细胞连接失稳，中性粒细胞跨内皮迁移到达肺泡[25]。中性粒细胞在迁移至肺泡前及肺泡后会形成以DNA为骨架的包含中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组蛋白（H3）、髓样过氧化物酶（MPO）等颗粒蛋白和胞质蛋白为主的中性粒细胞胞外捕获网（NETs）。NETs会通过H3及NE直接损伤肺泡上皮及内皮造成肺泡损伤[26]。

鉴于VE-Cadherin在维持内皮屏障完整性中的重要性，已有研究把VE-Cadherin作为内皮屏障修复的靶点。VE-Cadherin主要通过磷酸化、内吞和纤维蛋白重构引起内皮屏障破坏，因而干扰这些环节就可以在一定程度改善血管内皮屏障功能。

VE-Cadherin胞内区尾部含有9个酪氨酸磷酸位点，其中Y645、Y658、Y685、Y731和Y733参与维持内皮屏障完整性。Src信号通路激活，造成VE-Cadherin酪氨酸位点磷酸化是造成内皮屏障受损的主要原因，因而抑制Src信号通路可以减少内皮屏障破坏。Dong等[14]研究发现，氧二十碳三烯酸（EET）可以通过降低Src与GRP78交联和活性氧（ROS）产生，抑制RhoA/ROCK信号通路活化，避免LPS诱导的VE-Cadherin磷酸化，保护了内皮屏障的完整性。

Chichger等[27]应用免疫共定位研究发现，Rab4活化能够快速地使早期内涵体运输到细胞膜表面，从而稳定VE-Cadherin在内皮细胞表面的表达，减少其内化。LPS诱导的VE-Cadherin内吞的机制可能与其引起的Rab5a的上调及活性增加相关，抑制Rab5a表达后可以明显减少LPS引起的内皮细胞中VE-Cadherin的内吞。前文已述，VEGF会激活VEGFR-2-Src-Vav2-Rac-PAK信号通路，会造成VE-Cadherin磷酸化及内吞，因而VEGFR-2、Src、Rac及PAK抑制剂均可一定程度抑制VE-Cadherin的内吞，稳定内皮屏障。

内皮细胞线性粘附连接和局灶性粘附连接的失衡是通透性增高的重要基础。Rho-ROCK信号通路可以使F-actin形成应力纤维，细胞连接变为局灶性粘附连接，内皮屏障通透性增加；而Cdc42/Rac信号通路则可以维持线性粘附连接状态。Ras家族的Rap1作为上游因子，可以抑制Rho-ROCK信号通路、活化Cdc42/Rac信号通路，从而抑制局灶性粘附连接形成，维持线性连接，保持内吞细胞屏障完整性。研究表明，007作为cAMP类似物，通过007-Epac-Rap1-Rho/Cdc42信号通路抑制VEGF、组胺和LPS造成的血管通透性增高[28]。Y27632/Fasudil作为ROCK抑制剂可以通过抑制Rho-ROCK信号通路，减轻脓毒症小鼠肺损伤和过敏性休克小鼠的肺血管高通透性[29-30]。肝素作为最常用的抗凝剂可以通过抑制RhoA-ROCK减轻LPS所致的肺血管通透性增高[31]。

NETs会通过H3、NE和MPO直接损伤肺泡上皮及内皮造成肺泡损伤，应用组蛋白抗体、MPO抑制剂可明显减轻肺部损伤[26]。Clark等[32]研究发现，应用TLR4拮抗剂Eritoran（E5564）可以抑制LPS与血小板TLR4结合, 进而减少NETs生成，进而推测可能减轻肺血管内皮屏障损伤。DNA是NETs的骨架结构，DNase可特异性地作用于DNA的磷酸二酯键，直接水解DNA分子。Liu等[33]在脓毒症小鼠模型中研究发现，应用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）能显著降解NETs，减轻肺损伤。

综上，以VE-Cadherin为核心的粘附连接在维持细胞屏障完整性方面至关重要。深入研究VE-Cadherin-catennin-F-actin复合体的磷酸化、内吞及重构的变化规律及机制，寻找新的治疗靶点对于修复ALI/ARDS内皮屏障功能，并从基础向临床转化具有重要意义。