APTT纠正试验结果常用判定方法临界值建立及诊断效能评价

活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT) 纠正试验是对不明原因APTT延长的患者进行原因筛查的一线试验方法，可为指导临床诊断治疗提供重要的参考。当患者血浆和正常混合血浆(normal pooled plasma，NPP) 混合后APTT结果被纠正，表明患者血浆中凝血因子不足，因此可进行特异性因子活性测定以确定缺乏的凝血因子。当混合后APTT结果并未被纠正，表明有抑制剂的存在，如狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA) 或特定的凝血因子抑制物，前者是即刻反应抑制物，后者主要是凝血因子Ⅷ (FⅧ) 抑制物，通常依赖于时间和温度。目前临床上暂无统一的结果判定方法和临界值[1]。国内实验室大部分使用国外小样本研究所得数据，并未建立更适合国内及本实验室检测系统的临界值，因此，对于结果的解释有时并不恰当。本研究拟建立4种常用APTT纠正试验结果判定方法临界值，并进行效果评价，旨在选择更适合本实验室的方法。完整的APTT纠正试验包括即刻试验和孵育试验，本研究仅对即刻试验进行分析。

回顾性分析2019年3月至2021年10月就诊于中国医科大学附属第一医院不明原因APTT延长并进行APTT纠正试验，且明确APTT延长原因的116例患者的资料。其中，抑制物阳性71例，因子缺乏45例；抑制物阳性包括LA阳性61例，FⅧ抑制物阳性9例，FⅤ抑制物阳性1例；因子缺乏包括vWD2例，FⅫ缺乏10例，FⅪ缺乏3例，FⅨ缺乏4例，FⅧ缺乏13例，FⅤ缺乏2例，FⅡ缺乏1例，同时也收集了使用华法林导致多因子缺乏标本10例。男42例，女74例，中位年龄43.5 (1~78) 岁。通过凝血因子检测明确所缺乏凝血因子及其水平，通过稀释蝰蛇毒凝血时间试验和硅凝固时间试验检测LA，且检测至少间隔12周，LA阳性≥2次，最终确认为LA阳性标本。通过Bethesda方法检测凝血因子抑制物。排除使用肝素、直接凝血酶抑制剂的标本。同时排除分析前误差，如肝素污染、标本送达延迟、EDTA污染、标本凝固、溶血、标本量不足等。

应用STA-R EVOLUTION凝血分析仪进行APTT相关所有检测，所用试剂为STA®-PTT A。试剂1含有兔脑磷脂和硅土(激活物) 的冻干粉，试剂2为0.025 mol/L CaCl2。应用ACL TOP-750凝血分析仪及配套试剂进行LA检测。

选取健康体检者的3.2%枸橼酸钠抗凝血20份，男女比例相等，年龄18~55岁，常规凝血试验结果正常，避免选择感染、肿瘤、创伤、妊娠、新生儿等人群标本；确保每个单独血浆标本血小板计数 < 10×109/L；将收集标本混合后，以1 500 g离心15 min2次；排除LA阳性。

将等量的患者血浆与NPP混合后，将患者血浆、NPP和混合后血浆立即装载至凝血分析仪进行检测，所得APTT分别为PAPTT、NAPTT、MAPTT。

(1) 目前最常用的方法是循环抗凝剂指数[也称为罗斯纳指数(Rosner index，RI)]，RI (%) = [(MAPTT-NAPTT) /PAPTT]×100；(2) 百分比纠正法，纠正百分比(%) = [(PAPTT-MAPTT) / (PAPTT-NAPTT)]×100；(3) 正常参考范围法，MAPTT结果不超过APTT正常参考范围上限，本实验室建立本地APTT正常参考范围上限为43 s；(4) 差值法，即MAPTT与NAPTT的差值。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，受试者操作特征(receiver operating characteristic，ROC) 曲线评估不同判定方法对APTT纠正试验结果的诊断效能，即区分因子缺乏和抑制物阳性的能力，同时确定最佳临界值。比较4种方法设定的最佳临界值对即刻APTT纠正试验结果诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。应用散点图分析因子缺乏和抑制物阳性标本对不同判定方法所得结果的分布情况。对单因子缺乏标本的因子浓度水平与结果判定方法进行Pearson相关性分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

通过ROC曲线评估4种方法区分凝血因子缺乏和抑制物阳性能力的诊断效能。即刻APTT纠正试验结果若为纠正，即因子缺乏，反之为不纠正，即抑制物阳性。各判定方法曲线下面积(area under the curve，AUC) 见表 1。

通过ROC曲线建立RI法、百分比纠正法及差值法的最佳临界值分别为12.2%、62%、7.4 s，本实验室APTT正常参考范围上限值为43 s，各方法临界值所对应的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值见表 2。

以不同判定方法的目标参数为纵坐标，导致APTT延长的病因为横坐标，制作散点图，分析标本在不同结果判定方法中分布的具体情况。结果如图 1所示，单独任何一种方法都无法完全区分因子缺乏和抑制物阳性。RI < 12.2%基本可识别出因子缺乏标本(图 1A)；纠正百分比 > 62%可识别出全部因子缺乏标本(图 1B)；差值法设定7.4 s为临界值时对华法林引起的多因子缺乏识别能力差(图 1C)；所有FⅧ抑制物阳性标本MAPTT均大于正常参考范围上限43 s (图 1D)。

为探讨凝血因子水平与不同判定方法所得结果是否有相关性，将单因子缺乏标本(35例) 凝血因子水平与RI法、百分比纠正法、差值法、正常参考范围法结果进行相关性分析。以上相关参数通过Kolmogorov-Smirnov检验均服从正态分布，进行Pearson相关性分析。因子浓度与RI法、百分比纠正法、差值法、正常参考范围法的相关系数r分别为0.536(P < 0.01)、-0.710 (P < 0.01)、0.225 (P > 0.05)、0.216 (P > 0.05)，因子浓度水平与RI法结果呈中等正相关，与百分比纠正法结果呈显著负相关，与差值法和正常参考范围法无相关性。

虽然内源性凝血因子缺乏和抑制物阳性(主要是LA阳性) 都能使APTT延长，但在临床上表现为完全不同的症状，大部分严重的因子缺乏会导致出血，而LA阳性是高凝状态易形成血栓，在治疗上也是采取完全不同的手段。因此，明确无明显症状仅表现为APTT延长的患者的诊断对于治疗至关重要，临床和实验室标准化协会制定的指南强调对于LA的检测，筛选、混合和确认试验都是必要的[2]，遗漏混合试验会给最终结果带来假阳性或假阴性[3]。但由于各实验室使用APTT试剂不同，其成分中的激活剂不同，磷脂的来源、性质和总浓度不同，APTT试剂对肝素、LA和凝血因子缺乏的灵敏度和特异度也大不相同[4-5]。文献[6]表明，6种不同APTT试剂RI临界值介于11.5%~15.6%之间。因此，应建立属于本地实验室的结果判定值。

本研究对目前的即刻APTT纠正试验的结果判定方法中常用的4种进行了比较，包括RI法、百分比纠正法、MAPTT与NAPTT差值法和正常参考范围法，并重新建立了前3种方法的临界值。但无论哪种方法都无法完全将因子缺乏和抑制物阳性区分开。本研究中RI的临界值为12.2%，与文献[7]报道的RI临界值10%~15%相符。本研究中，百分比纠正法临界值≥62%，所有因子缺乏标本均被纠正，因此百分比纠正法最大的意义在于 < 62%可排除因子缺乏。与以往研究[8]结果相同，正常参考范围法中FⅧ抑制物标本均为部分纠正。虽然FⅧ抑制物是时间温度依赖的抗体，但高滴度的FⅧ抑制物也可起快速抑制作用[9-10]。从正常参考范围法散点图中可发现，无论FⅧ抑制物滴度如何，都不会被纠正至APTT正常范围内。如血友病等长期因子缺乏患者近期出现出血症状或APTT逐渐升高，临床医生无法确定是否产生FⅧ抑制物，可通过此方法进行排除。因子抑制物检测方法昂贵，一般实验室尚未开展，更无法在资源匮乏的环境中进行基于人群的筛查。本研究结果显示，只要混合后APTT结果不超过正常参考范围上限，即可排除FⅧ抑制物的存在，无需进行因子抑制物检测。当然，这需要扩大样本量进一步验证。但这一方法的不足之处在于试剂批号更换时要频繁验证参考范围。差值法没有将患者APTT结果纳入判定结果计算，只考虑NPP和混合后APTT结果，将二者的差值作为判定标准，理论上并不科学。因患者APTT延长的程度一定程度上会影响混合后APTT结果，应将患者APTT也考虑到最终结果计算中，而不是用绝对值作为判定目标值。

本研究发现，因子缺乏程度与RI法结果呈正相关，与百分比纠正法结果呈负相关，即因子缺乏程度越大，结果被纠正的程度越大，因子轻度缺乏的标本被纠正的程度小，甚至不被纠正，与ORELLANA等[11]的研究结果一致。在无法进行因子浓度检测的实验室，可根据RI法和百分比纠正法结果大致判断患者的因子缺乏程度。在各种方法的结果判读中，总是存在LA阳性标本在纠正试验中被纠正，这些标本均为LA弱阳性者，在即刻纠正试验中，低滴度的LA抑制物被稀释，无法发挥直接抑制作用，而表现出被纠正的假阴性结果[12]。对于使用华法林所致多因子缺乏标本，RI法和百分比纠正法几乎均可得到标本被纠正的结果，而差值法和正常参考范围法区分这类标本的能力欠缺。在单因子缺乏引起APTT延长的标本中，最常见的是FⅫ缺乏，FⅫ在内源性途径的启动中起关键作用，其不足会导致血栓形成，而不会出现其他凝血因子缺乏引起的出血[13]。

综上所述，每种判定方法都有各自的特点和适用人群，可以尝试对临床特定需求使用特定判定方法和临界值。各方法新建立的临界值可更好地识别因子缺乏和抑制物阳性的标本，且与其他3种方法相比，RI法用到了所有的APTT结果，使最终判定结果更准确客观，可最大程度排除各种系统误差对结果带来的影响，无论是从判断因子缺乏还是抑制物阳性都有较好的灵敏性和特异性，且具有最大的AUC，可作为本实验室APTT纠正试验结果首要常规判断方法。本研究的局限性在于研究方法是回顾性分析，无法保证不同人员操作的差异，最终可能给结果带来的影响也无法评估。由于FⅧ抑制物标本量少，本研究未对孵育试验的结果进行分析。