胚胎的“冬眠”

我们的胚胎冷冻3年了，会不会冻坏了呀，会不会对宝宝有伤害呀？

冷冻胚胎解冻后，会不会失败呀？

冷冻胚胎的成功率，会不会比新鲜胚胎差呀？

关于胚胎冷冻，相信不少朋友都会有这样的疑问，那胚胎冷冻究竟是怎么一回事呢？

胚胎冷冻复苏简介

01、胚胎冷冻的原理

低温能降低细胞新陈代谢水平，抑制细胞生命活动，处于超低温下的细胞，其新陈代谢几乎完全停止，使细胞能够被长期保存。胚胎冷冻通过特殊的保护措施和降温程序将胚胎存放在超低温环境中，而复温后又恢复代谢能力，从而达到维持胚胎原有生物活性，长期保存胚胎的目的。

目前，最常用的低温环境为液氮，保存温度为-196℃。常用的小鼠冷冻方法是玻璃化冷冻[1]。

02、玻璃化冷冻的定义

玻璃化是指在快速的降温过程中，液体粘性会急剧上升并且转变成一种玻璃状的非晶体状态。玻璃化的优点在于不会改变分子的无序状及原有的结构顺序，且无冰晶产生。对胚胎进行玻璃化冷冻操作首先要将其暴露于高浓度的冷冻保护剂中进行快速脱水皱缩，待其完全脱水后再置于冷冻载体上，最后直接投入液氮中迅速降温。胚胎在液氮中处于静止状态，可以长期保存。待到再次使用时，可以使用冷冻保护剂进行胚胎复苏，逐步稀释胚胎内部及表面的冷冻保护剂，最终使胚胎恢复到正常生理状态[2]。

03、冷冻胚胎的复苏

胚胎的解冻与冷冻相反，是将胚胎从超低温状态下恢复至正常生理状态的过程。解冻主要有两个过程，一个是复温，一个是去除冷冻保护剂，最终达到恢复胚胎生理活性及继续发育的目的。

复温一般采用较快的升温速度，避免在中间产生一些冰晶对胚胎造成损伤，胚胎冷冻时，胚胎中渗透了高浓度的冷冻保护剂，复温后需及时将其去除，使水分能替代保护剂渗入细胞内，因此解冻剂中含有一些非渗透性保护剂，胚胎可逐步吸收水分，并将冷冻剂从胚胎细胞中渗出，且不会因水分吸收过快而导致细胞膜内外渗透压剧烈变化，对胚胎造成损伤。

胚胎解冻时选择何种方法需依据胚胎冷冻时选择的方法，不同的冷冻方法不仅冷冻原理有差别，且胚胎装载的方式也完全不同，因此解冻时也需采用不同的解冻方法和程序，解冻方法需与冷冻时的方法相对应，这样更有利于胚胎的复苏及生理功能的恢复，不恰当的复苏方法会对胚胎造成较大的损伤。

04、胚胎冷冻保护剂

冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两种。

渗透性冷冻保护剂又称细胞内冷冻保护剂，渗透性冷冻保护剂对细胞有不同程度的毒性作用，能影响细胞的微管和微丝的组成和功能，主要有乙二醇(ethylene glycol，EG)、丙二醇(1，2-propenadiol，PG)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO或Me2SO)、丙三醇(又称甘油glycerol，GL)、乙酰胺(AA)等。

非渗透性冷冻保护剂又称细胞外冷冻保护剂，均为大分子聚合物，在细胞膜完整的情况下，不能自由扩散透过细胞膜，作为渗透缓冲剂能提高细胞外液的渗透压，控制水进入细胞的速度，减少解冻复温时引起的渗透休克，从而避免造成细胞破裂和细胞肿胀，主要有蔗糖(sucrose)、葡聚糖(dextran)、聚蔗糖(ficoll)等。

将两种冷冻保护剂联合应用，既能促进玻璃化过程，又提高冷冻效率，能减少两者的用量，从而减轻高浓度的冷冻保护剂的细胞毒性作用。

胚胎冷冻复苏操作

01、胚胎DAP玻璃化冷冻操作

过滤1M DMSO后，在培养皿上滴入4个滴液（~100µL/个）。其中一滴用于清洗从培养基里采集的胚胎，其余三个用于存放已清洗的胚胎。

把全部胚胎放入其中一个滴液里，清洗沾有培养基的胚胎。清洗后的胚胎平均放进其余的3个滴液里。这3个等份的胚胎最终将会转移至储存小瓶里。

例如，采集了120个胚胎，分成3个等份，每一等份40个，这些胚胎首先会一起放到清洗的滴液里，然后再分成3份放进3个滴液里。

使用20µL移液管和灌注凝胶枪头，转移5µL的1M DMSO溶液的胚胎至冻存管内。转移后，立即将冻存管放置0℃冷却器内5分钟。

注意：冻存管可以放在0℃冷却器中超过5分钟（