【抗体药物活性检测方法】报告基因细胞检测ADCC效应原理简介

NK细胞介导的ADCC疗法

抗体依赖性细胞介导的细胞毒性疗法-ADCC：（a）抗体的Fc段和NK细胞的FcγR结合使NK细胞激活，诱导效应分子的释放，其中包括穿孔素和颗粒酶。（b）一端靶向NK细胞侧的CD16，另一端靶向肿瘤特异性抗原的双特异性抗体能增强NK细胞和肿瘤细胞的特异性结合。

图3. 基于NK细胞的ADCC疗法

上述两种ADCC疗法中的抗体起到了调控NK细胞活性的作用，是抗肿瘤抗体药物研发的重点。在这类抗体的研发过程中，NK细胞是常用来检测抗体ADCC效应的细胞。

NK细胞检测抗体ADCC效应

使用NK细胞能真实反映抗体对靶细胞的ADCC效应，但是NK细胞通常需要从全血或者PBMC中进行分离，需要较高的实验技巧，实验周期长且实验结果不易重复。传统的检测ADCC效应的方法有以下三种：

ADCC效应检测的最经典的方法是铬51(51Cr) 标记/释放法。将具有放射性的铬51与靶细胞孵育，铬51会进入靶细胞；洗去多于未进入细胞的铬51，再将靶细胞和效应细胞以及抗体共同孵育。如果靶细胞被杀伤，铬51就会被释放出来，检测溶液中的放射性同位素含量即可确认靶细胞被杀伤的情况。该方法是ADCC检测靶细胞被杀伤的金标准，然而因为带有放射性元素、费时费力且实验变化性大而较少使用。

细胞毒性测试 (Cytotoxicity assay) 利用类似铬51的原理但使用荧光的方法来检测靶细胞的死亡，如calcein-AM本身没有荧光且很容易地进入活细胞，进入活细胞后就变身成强荧光的calcein，若细胞被杀伤，荧光信号就可以在胞外被检测到。此方法可用于高通量快速筛选并获得实验同质性高的结果，然而效应细胞自身也会裂解导致高背景值的讯号产出。

CFSE(carboxy fluorescein succinimidyl ester)，利用双重染料：CFSE标记靶细胞，FVD标记死细胞，以流式细胞术来定量ADCC杀伤靶细胞的方法。此方法以多参数方法进行检测，操作简单并可获得可信的实验结果。

ADCC效应检测新方法

InvivoGen开发检测ADCC效应的报告基因细胞，可替代传统的依赖于NK细胞毒性活性的检测方法，用于抗体药物的初期筛选，大大提高筛选效率。在生物使用中，使用基因工程改造的人源T细胞系来检测NFAT（活化T细胞核因子）激活，这是ADCC诱导的早期信号。通过测量NFAT依赖的荧光素酶报告蛋白产生的生物发光信号，可以显示ADCC的诱导水平。

效应器报告基因细胞系

Jurkat-LuciaTM NFAT-CD16细胞

由人源T淋巴细胞Jurkat细胞系进行基因工程改造而得。细胞系在最小启动子和6个NFAT反应原件的控制下稳定表达Lucia荧光素酶报告基因，以及细胞表面Fc受体CD16a（FcγRIIIA; V158高亲和力同种异体）。Jurkat细胞天然表达NFAT功能性信号通路。

Jurkat-Lucia NFAT-CD16细胞已经用不同的靶细

胞和特定的单克隆抗体同种型组合进行功能测试

图4. ADCC报告细胞基础检测法。1-ADCC 诱导：将表达表面抗原的靶细胞与特异性单克隆抗体一起培养1小时，之后以适当的靶效比添加Jurkat-LuciaTM NFAT-CD16效应细胞并培养6小时。2-添加荧光素酶检测试剂Quanti Luc™ : 将检测试剂添加到上清液样品中。3-ADCC测量：使用荧光读数仪检测生物发光信号。

免疫检查点抑制剂靶细胞

● Raji-hCTLA4细胞

● Raji-hPD-1细胞

● Raji-hPD-L1细胞

● Raji-hTIGIT 细胞

这四个细胞系属于Raji（人B淋巴细胞）衍生靶细胞系列，这些靶细胞不仅稳定表达免疫检查点如人CTLA-4、人PD-1、PD-L1、TIGIT，而且表达肿瘤抗原如HER2、EGFR和CD20（Raji 细胞天然表达的抗原）

实验数据：

图5. 使用Raji-hCTLA4靶细胞比较抗人CTLA4天然和工程化同种型的ADCC效应

将Raji-hCTLA4细胞与梯度稀释的抗-hCTLA4或抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体培养1小时。然后把Jurkat LuciaTM NFAT-CD16效应细胞与靶细胞共培养6小时。通过使用Quanti-Luc测定上清液中荧光素酶活性来评估。

高表达细胞株列表

靶点 备注

ADCC CD16a（158V）过表达及下游报告基因细胞株

ADCC CD16a（158F）过表达及下游报告基因细胞株

ADCC 杀伤机制，CD16a（158V）过表达细胞株

ADCP CD32a 过表达及下游报告基因细胞株

PD-1/PD-L1 PD-L1 过表达细胞

PD-1/PD-L1 PD-1 过表达及下游报告基因细胞株

IL-6 等 STAT3 过表达及下游报告基因细胞株

TGF-β 等 Smad 过表达及下游报告基因细胞株

CD3 CD3 过表达及下游报告基因细胞株

PD-L1 PD-L1 过表达细胞

NFκ B NFκ B 过表达细胞株

GH GHR 过表达及下游报告基因细胞株

FSH FSHR 过表达及下游报告基因细胞株

4-1BB 4-1BB 过表达及下游报告基因细胞株

OX40 OX40 过表达及下游报告基因细胞株

VEGF KDR 过表达及下游报告基因细胞株

GHR，PD-L1 GHR，PD-L1 过表达细胞株

EGFR EGFR 过表达及下游报告基因细胞株

C-met C-met 过表达及下游报告基因细胞株

CXCR4 CXCR4 过表达及下游报告基因细胞株

CD47/SIRPa SIRPa 过表达细胞株

CD47/SIRPa 吞噬机制，CD47 过表达及下游报告基因细胞株

CTLA-4/CD86 CD86 过表达细胞株

CTLA-4/CD86 CTLA-4 过表达及下游报告基因细胞株

TIGIT/CD155 CD155 过表达细胞株

TIGIT/CD155 TIGIT 过表达及下游报告基因细胞株

EGFR/CD3 CD3 过表达细胞株

EGFR/CD3 EGFR/CD3 双抗杀伤机制，EGFR 过表达及下游报告基因细胞株

CTLA-4/CD80 CD80 过表达细胞株返回搜狐，查看更多