质粒DNA的提取与纯化

大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒（CCC plasmid）DNA，简称闭环质粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体（vector），质粒在基因工程中应用十分广泛。有关质粒的提取与纯化是必须掌握的

大多数质粒都是双链的共价闭合环状质粒（CCC plasmid）DNA，简称闭环质粒（closed circular plasmid，CC plasmid）。作为携带外源基因在细菌中扩增或表达的重要载体（vector），质粒在基因工程中应用十分广泛。有关质粒的提取与纯化是必须掌握的基本技术。

提取与纯化的方法

质粒DNA的提取与纯化的方法很多，经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法等。这些方法主要由细菌的培养（质粒DNA的扩增）、细菌的裂解（质粒DNA的释放）及质粒DNA的分离与纯化等三个步骤组成。按制备量的不同，质粒DNA提取与纯化的方法可分为质粒DNA的小量（1ml～2ml）制备、质粒DNA的中量（20ml～50ml）制备及质粒DNA的大量（500ml）制备。

（一）碱裂解法

碱裂解法简单、重复性好而且成本低，是使用最广泛的方法。在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。尽管碱液能破坏核酸的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠结紧密而不会解链。只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复其天然状态。裂解后，细胞壁碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，这些复合物在高钾盐条件下，可有效沉淀，而质粒DNA保留于上清中。直接通过无水乙醇沉淀质粒DNA，并用70%的乙醇洗涤，其纯度可满足DNA测序与PCR等实验的要求。

碱裂解法是一种适用范围很广的方法，能从所有的大肠杆菌（E.coli）菌株中分离出质粒DNA，制备量可大可小。

（二）煮沸裂解法

煮沸裂解法是将细菌悬浮于含Triton X-100和溶菌酶的缓冲液中，Triton X-100和溶菌酶破坏细胞壁后，沸水浴裂解细胞的同时可破坏DNA链的碱基配对，并使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA变性，但CCC质粒DNA因结构紧密不会解链。当温度下降后，CCC质粒DNA可重新恢复其超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，然后回收上清中的质粒DNA。

煮沸裂解法是一种条件比较剧烈的方法，对于大质粒（ 分享到: 织梦二维码生成器 相关新闻 国产高通量基因测序仪获 2023-09-07 肠道“塞车”不容忽视 科 2023-09-05 唯择®（阿贝西利片）扩展 2023-09-05 首款尿液宫颈癌HPV筛查产 2023-09-04 昌平生命谷产业基地园区 2023-09-01