一种基于二茂铁和金丝桃素的复合纳米材料、制备方法及应用

1.本发明涉及基于二茂铁及金丝桃素介导的光动力治疗材料领域，特别是涉及一种基于二茂铁和金丝桃素的复合纳米材料、制备方法及应用。

背景技术：

2.目前实体瘤的治疗仍面临着巨大的挑战，肿瘤微环境中的抗氧化系统和免疫微环境是主要难题。肿瘤中的抗氧化系统可上调相应的抗氧化剂，尤其是谷胱甘肽(gsh)和谷胱甘肽过氧化物酶(gpx4)，减少脂质过氧化物(lpo)的生成，防止脂质过氧化物对细胞膜的损伤，从而促进肿瘤生长。因此，谷胱甘肽耗竭可以导致肿瘤细胞中活性氧积蓄，是提高抗肿瘤治疗效果的方法之一。3.铁死亡是一种铁依赖的程序性细胞死亡，在2012年由stockwell团队提出。铁死亡特征是大量的细胞毒性脂质过氧化物的积累杀伤肿瘤细胞。在肿瘤微环境中，谷胱甘肽过氧化物酶是清除脂质过氧化物的必需酶，铁死亡可消耗谷胱甘肽，阻断谷胱甘肽过氧化物酶的活性，从而产生剧毒的脂质过氧化物。同时亚铁离子参与芬顿反应，产生的活性氧可导致细胞膜破裂。由于肿瘤局部缺氧微环境，活性氧产生受限，疗效欠佳，故而寻找其他方法来提抗肿瘤治疗疗效是很重要的。4.光动力疗法(photodynamic therapy，pdt)是一种新型的肿瘤治疗方式，被广泛应用于肿瘤的治疗，用特定波长照射肿瘤部位，能使选择性聚集在肿瘤组织的光敏剂活化，产生一系列的活性氧自由基(ros)，继而出现细胞毒性、血管损伤和免疫调节等，引发光化学反应杀伤肿瘤。在pdt治疗过程中，光源具有时间和位置的可控性，可以避开正常组织在肿瘤中选择性滞留，精准产生和释放ros，从而实现肿瘤特异性pdt且副作用降到最低。最近的研究表明，pdt可以诱导和增强铁死亡疗效，同时可以通过释放损伤相关的分子模式(damp)，如crt、atp、hmgb1和触发免疫原性细胞死亡(icd)。尤其是表面钙网蛋白的暴露是icd的重要标志物，能发出“吃我”信号，刺激树突状细胞的抗原提呈功能，增强肿瘤细胞免疫原性。此外，已有研究报道，金丝桃素诱导的光动力治疗可产生高水平的活性氧，增强免疫原性细胞死亡。金丝桃素是一种常见的药用植物贯叶连翘的提取物，其单体高度疏水，给药时需要载体，常见的载体有脂质体、胶束和纳米颗粒等。故而针对目前肿瘤治疗中抗氧化系统和免疫微环境的主要难题，开发一种用于肿瘤治疗的光动力新型纳米材料，可以协同针对肿瘤抗氧化系统和免疫微环境，巩固并增强抗肿瘤治疗，这是本领域技术人员需要解决的问题。

技术实现要素：

5.本发明提供了一种纳米材料，该纳米材料在光照(595nm)条件下具有很高光动力转化效率，具有很好的抗肿瘤治疗疗效以及良好的生物相容性。6.本发明提供了一种基于二茂铁和金丝桃素复合纳米材料的制备方法，在四氢呋喃介质中加入聚乙二醇聚赖氨酸、二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯和金丝桃素，产物自组装形成所述基于二茂铁和金丝桃素复合纳米材料；7.其中，聚乙二醇聚赖氨酸(mpeg/npll)的结构式如式ⅰ所示：[0008][0009]其中，m＝10-500，n＝10-100。[0010]优选的，m的值为50-100，n的值为10-40，或者n的值为40-100。[0011]优选的，所述金丝桃素为单体金丝桃素，分子式：c30h16o8，分子量：504.45，cas号：548-04-9，其结构式如式ii所示：[0012][0013]所述二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯为fc-nhs。分子式：c15h13feno4，分子量：327.113，cas号：115223-09-1，其结构式如式iii所示：[0014][0015]金丝桃素、聚乙二醇聚赖氨酸和二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯的投料质量比为1-2∶5-20∶4-10。[0016]优选的，金丝桃素、聚乙二醇聚赖氨酸和二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯的投料质量比为1∶10∶8。[0017]优选的，二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯与二甲基亚砜的质量体积比为1g∶2-20ml。[0018]具体的，聚乙二醇聚赖氨酸和金丝桃素溶解在二甲基亚砜中，反应步骤为：[0019]聚乙二醇聚赖氨酸在二甲基亚砜中稀释，缓慢加入四氢呋喃形成胶束溶液，在上述胶束溶液中加入二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯，在室温下进行缩合反应，制得反应液，将含有金丝桃素的二甲基亚砜滴入上述反应液中，两种溶液均透析48小时后提纯得到最终样品即基于二茂铁和金丝桃素复合纳米材料。[0020]本发明的制备方法中，在室温下发生反应，二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯通过酰胺键化学键接在聚乙二醇聚赖氨酸上，将金丝桃素包裹在聚乙二醇聚赖氨酸中，形成复合纳米级材料。[0021]本发明又提供了所述制备方法制备的基于二茂铁和金丝桃素复合纳米材料。[0022]本发明通过将二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯接在聚乙二醇聚赖氨酸上，金丝桃素被包裹在其中，从而制备了基于二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯和金丝桃素复合纳米对比剂，得到粒径大小为120nm之间的球状纳米颗粒，可以通过纳米级大分子对比剂的实体瘤的高通透性和滞留(epr)效应富集在肿瘤组织中，提升局部药物浓度。[0023]本发明又提供了所述基于二茂铁和金丝桃素复合纳米材料在制备光动力治疗剂中的应用。本发明制备的纳米材料在波长为595nm具有一定量的吸收，研究发现，将本发明的纳米材料作用到肿瘤细胞中，在光照条件下，能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，是很好的抗肿瘤治疗剂。[0024]优选的，光动力治疗剂用于治疗肿瘤，所述肿瘤的类型为乳腺、皮肤、头颈部或甲状腺部位的实体瘤。[0025]本发明具备的有益效果：[0026](1)本发明制备基于二茂铁和金丝桃素的复合纳米材料，具有局部浓度高、抗肿瘤疗效好、肾清除迅速、生物兼容性高和毒副作用小等优点。[0027](2)本发明制得的纳米材料抗肿瘤疗效佳体现在：产生大量活性氧并耗竭肿瘤局部的谷胱甘肽，铁死亡和金丝桃素介导的光动力治疗产生协同作用，同时触发免疫原性细胞死亡，实现强大的抗肿瘤效果。附图说明[0028]图1为纳米材料peg/pll/fc/hyp在水中的动态光散射仪测得的粒径分布图。[0029]图2为纳米材料peg/pll/fc/hyp透射电镜图。[0030]图3为纳米材料peg/pll/fc/hyp水溶液、hyp单体dmso溶液的紫外-可见光吸收曲线图。[0031]图4为不同时间点4t1细胞吞噬纳米材料peg/pll/fc/hyp的流式细胞分析图(a)及激光共聚焦显微镜图(b)。[0032]图5为在有或无激光照射下(595nm，0.25mw·cm-2，5min)，纳米材料peg/pll/fc/hyp产生的活性氧以及脂质过氧化物的流式细胞分析图(a)、活性氧探针荧光强度图(b)及脂质过氧化物探针荧光强度图(c)。[0033]图6为在有或无激光照射下(595nm，0.25mw·cm-2，5min)纳米材料peg/pll/fc/hyp对抗4t1细胞(a)、ct26细胞(b)、b16f10细胞(c)的增殖效果图。[0034]图7为在有或无激光照射下(595nm，0.25mw·cm-2，5min)，与纳米材料peg/pll/fc/hyp共培养后4t1细胞凋亡流式细胞分析图(a)及激光共聚焦显微镜图(b)。[0035]图8为在有或无激光照射下(595nm，0.25mw·cm-2，5min)，用蛋白质免疫印迹法检测4t1细胞经过peg/pll/fc/hyp纳米材料处理后gpx4、细胞膜crt、总crt蛋白量的变化图。[0036]图9为纳米材料peg/pll/fc/hyp对4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠肿瘤的抑制实验中肿瘤生长曲线图；“***”代表p《0.001。[0037]图10为纳米材料peg/pll/fc/hyp对4t1乳腺癌细胞荷瘤balb/c小鼠肿瘤的抑制实验过程中，balb/c小鼠体重变化曲线图。具体实施方式[0038]实施例1[0039]1、纳米材料的制备[0040](1)聚乙二醇聚赖氨酸(peg100/pll40)(100mg，1eq)在200μl二甲基亚砜中稀释，缓慢加入10ml四氢呋喃形成胶束溶液。[0041](2)在步骤(1)中胶束溶液中加入fc-nhs(二茂铁甲酸n-琥珀酰亚胺酯，80mg，15eq)，与peg/pll中pll上的-nh2残留物反应。反应在室温下保温过夜，制得peg/pll/fc溶液。[0042](3)将含有10mg金丝桃素的200μl dmso溶液，滴入peg/pll/fc溶液中，从而制备得到peg/pll/fc/hyp溶液。[0043](4)将peg/pll/fc和peg/pll/fc/hyp两种溶液透析48小时提纯。[0044]2、纳米材料的性能分析[0045](1)采用动态光散射粒度仪(dls)测定上述制备的peg/pll/fc/hyp纳米颗粒的平均粒径和粒径分布。取2μm(1ml)的peg/pll/fc/hyp溶液置于dls仪器进行测定，如图1所示，peg/pll/fc/hyp纳米颗粒平均粒径在122nm。[0046](2)采用透射电子显微镜(tem)测定peg/pll/fc/hyp纳米颗粒的形貌、分布和粒径大小。取2μm(1ml)的peg/pll/fc/hyp溶液浸没在铜网(400目，碳支持膜)中5分钟左右，用镊子轻轻取出铜网，再用洁净的滤纸吸除多余液体并烘干，置于tem仪器上，观察样品的形貌与粒径并存储图像。如图2所示，由tem再次验证了纳米颗粒的尺寸，并且可以看到纳米对比剂呈较规则的均一球形，而且大小都比较均匀。[0047](3)用酶标仪测定了peg/pll/fc纳米粒子和peg/pll/fc/hyp纳米粒子的紫外-可见吸收光谱。如图3所示，在595nm处有较强的近红外吸收，说明hyp单体与peg/pll/fc结合，成功合成了peg/pll/fc/hyp纳米粒子。[0048](4)4t1细胞对纳米粒子的摄取实验：在不同时间点将4t1细胞与peg/pll/fc/hyp纳米粒子共培养，随后分别用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜(clsm)进行分析，观察不同时间点4t1细胞对peg/pll/fc/hyp纳米粒子的摄取情况。如图4所示，4t1细胞摄取peg/pll/fc/hyp的比例随时间增加，证实peg/pll/fc/hyp可被4t1细胞逐渐摄取，clsm图像通过荧光强度进一步验证了细胞对peg/pll/fc/hyp比游离单体hyp的摄取更多。[0049](5)观察活性氧(ros)和脂质过氧化物(lpo)的产生：采用活性氧荧光探针(dcfh-da)和脂质过氧化荧光探针(c11 bodipy 581/591)法观察细胞内活性氧和脂质过氧化产物的生成。4t1细胞接种于六孔板和共聚焦培养皿中，分别与hyp单体、peg/pll/fc和peg/pll/fc/hyp纳米颗粒孵育2h，激光照射(595nm，0.25mw·cm-2，5min)。然后，用pbs洗涤细胞，再分别用10μm的dcfh-da和5μm的c11 bodipy 581/591孵育20min。用流式细胞仪分析并用激光共聚焦显微镜直接观察。如图5所示，加入peg/pll/fc/hyp纳米粒子并经过光照的的细胞荧光最强，表面产生的ros和lpo更多。[0050](6)采用cck-8法检测peg/pll/fc/hyp纳米颗粒对4t1细胞、ct26细胞以及b16f10细胞的体外毒性。处于对数生长期的细胞分别铺在96孔板中培养过夜贴壁后，分别加入不同浓度的peg/pll/fc、peg/pll/fc/hyp纳米颗粒和hyp单体2h后，细胞暴露于黄光照射(595nm，0.25mw·cm-2，5min)，再孵育24h，孵育时间完成后再在各个孔中加入20μl cck-8溶液(5mg/ml)，继续孵育4h，将96孔板置于酶标仪上读取吸光度值(562nm与620nm的差值)，间接反映dhm纳米对比剂对细胞的毒性作用。如图6所示，peg/pll/fc/hyp纳米颗粒+光照组，hyp单体+光照组两组对三种细胞的毒性较强，尤其是对b16f10有明显的细胞毒性，4t1细胞、ct26细胞以及b16f10细胞ic50值分别为3.708μm、1.577μm和1.154μm，均有较高的抗肿瘤活性。可见hyp单体配合光动力治疗杀伤肿瘤细胞效果好，但是其单体水溶性差，体内给药难以实现；而peg/pll/fc/hyp纳米颗粒在各介质中均有良好的分布，配合光照具有高效的抗肿瘤效果。[0051](7)使用annexin v-fitc/7-aad荧光双染细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡测检测，用流式细胞术研究了细胞凋亡。用annexin v-fitc和7-aad对处理后的4t1细胞进行染色。如图7所示，peg/pll/fc/hyp+光照组出现明显的晚期凋亡，且明显强于hyp单体+光照组。未经激光处理的peg/pll/fc/hyp组4t1细胞晚期凋亡水平也较低。相比之下，peg/pll/fc组对细胞活性的影响较小。这一现象证实了经过peg/pll/fc/hyp纳米颗粒加光照处理后在诱导细胞凋亡方面起到了很好的作用。激光共聚焦显微镜观察到，4t1细胞与annexin v-fitc/7-aad孵育后活细胞呈现绿色，凋亡细胞呈现红色，细胞经peg/pll/fc/hyp和光照处理后，照射区凋亡细胞为主，而非照射区活细胞为主，这进一步证实了上述结论。[0052](8)采用蛋白免疫印迹法检测gpx4蛋白和crt蛋白在细胞中的表达。4t1细胞首先与pbs、hyp单体、peg/pll/fc和peg/pll/fc/hyp纳米粒孵育24h。用595nm激光(0.25mw·cm-2，5min)光照。用pbs漂洗，然后加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液中裂解。随后用膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜crt蛋白。用化学发光法对蛋白质进行成像，并用image j软件进行分析。如图8所示，经peg/pll/fc/hyp和光照处理后，gpx4的表达水平降低。治疗后细胞膜crt表达增加，而总crt蛋白表达无明显变化。这些结果间接表明peg/pll/fc/hyp纳米颗粒可诱导细胞膜表达crt，这是诱导铁死亡和免疫原性细胞死亡的重要标志。[0053](9)进一步研究peg/pll/fc/hyp纳米粒在体内的抑瘤效果。建立小鼠原位乳腺癌模型：鼠源乳腺癌4t1细胞(5×105，200μl)接在雌性balb/c小鼠左侧腹部第三对乳腺处。当肿瘤平均体积达到73mm3后，小鼠随机分成5组(n＝5)，治疗分别为：(1)pbs组；(2)peg/pll/fc；(3)peg/pll/fc/hyp(金丝桃素当量0.5mg/ml)；(4)hyp单体(金丝桃素当量0.5mg/ml)+595nm光照(595nm，2.5w·cm-2)；(5)peg/pll/fc/hyp(金丝桃素当量0.5mg/ml)+595nm光照(595nm，2.5w·cm-2)。每三天注射一次，共5次，给药后密切观察小鼠状态，每两天测量肿瘤体积和体重。如图9所示，在peg/pll/fc/hyp+光照组显示出良好的抗肿瘤效果好，15天内的肿瘤明显缩小，基本消失，而peg/pll/fc组、仅peg/pll/fc/hyp组、hyp单体+光照组和pbs组三组肿瘤生长较快，组与组之间具有统计学差异(p《0.001)。如图10所示，实验组与其他三组对照组的小鼠体重均未出现明显下降。表明peg/pll/fc/hyp纳米粒具有良好的生物相容性，且经尾静脉注射全身毒性低。[0054]实施例2[0055]根据表1的反应条件制备纳米材料，工艺流程参照实施例1制得的纳米材料粒径见表1。[0056]表1[0057][0058]由表1可知，当聚乙二醇聚赖氨酸、金丝桃素与二茂铁的质量比为10∶1∶8时，所获纳米材料的粒径最好。当金丝桃素或者二茂铁的浓度不断增加时，纳米材料的粒径分布不断增大，过大的纳米颗粒无法经epr效应富集在肿瘤组织附近，且容易被网状内皮系统截留，使磁共振造影和光动力治疗效果下降。[0059]实施例3[0060]根据表2的mpeg/npll，工艺流程参照实施例1制得的peg/pll粒径见表2。[0061]表2[0062]m/pegn/pll平均粒径/nm1010‑‑5010101004011050040‑‑100100910[0063]“‑‑”表示粒径太大，测不出来。[0064]由表2可知，peg比例太高不成颗粒，pll比例高粒径大。