二妙散治疗类风湿关节炎的作用机制

2.2   类风湿关节炎相关靶点的获取   从 Genecards数据库获得类风湿关节炎靶点4 329个。根据经验设定Score值大于中位数的目标靶点为类风湿关节炎的潜在靶点。GeneCards 数据库中，类风湿关节炎靶点Score值最大值为114.78，最小值为0.23，中位数为1.82，因此Score > 1.82的靶点为类风湿关节炎的潜在靶点。然后，结合其他数据库进行补充，最终预测了2 247个类风湿关节炎相关靶点。 2.3   二妙散成分-类风湿关节炎靶点-通路网络的构建   将预测的二妙散药物靶点与类风湿关节炎疾病靶点取交集，并通过Venny绘制韦恩图，得到二妙散成分-类风湿关节炎共同靶点132 个，见图1。将这132个靶点录入STRING，获得了PPI网络，并导入Cytoscape软件绘制蛋白关系PPI网络图，见图2。该网络包括132个节点，共524条边。节点的大小、颜色与此节点的Degree值成正比，即节点越大、颜色越深对应蛋白的Degree值越大。使用插件CytoHubba计算出得分较高的关键作用靶点，见图3，包括肿瘤坏死因子、JUN、白细胞介素1B、RELA、白细胞介素4、白细胞介素6、CXCL8、CCL2、白细胞介素2和IFNG，这些靶点在蛋白网络中具有枢纽的重要地位，在二妙散治疗类风湿关节炎中具有重要意义，可作为其有效成分作用的靶点。

由于 PPI 网络中蛋白的作用是相互的，所以通常归为无向图。PPI复杂网络中存在部分密度较高的区域称为模块(module)，是 PPI 网络中潜在的子网，其连线密度较高，具有生物学意义[13]，所以为了能更加精确地分析二妙散治疗类风湿关节炎的作用机制，在得到二妙散 PPI 网络后，有必要进一步识别其内在的模块。因此，运用Cytoscape 3.8.0软件中的MCOED插件，得到Module，见图4。根据P值，分别保留PPI网络与Module中3个最佳评分的生物学进程，并对其进行功能描述，见表3。

2.4   靶点功能与通路的富集分析   文章采用 Metascape平台对二妙散治疗类风湿关节炎相关靶点进行信号通路分析，并使用 Origin Lab 9.1软件绘图。二妙散主要参与的生物学过程包括生物对有毒物质的应答过程(response to toxic substance)、对无机物的应答过程(response to inorganic substance)、对脂多糖的应答过程(response to lipopolysaccharide)、对细菌源分子的应答过程(response to molecule of bacterial origin)，细胞因子介导的信号通路(cytokine-mediated signaling pathway)，细胞凋亡信号通路(apoptotic signaling pathway)，见图5A，参与的通路主要有AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、白细胞介素17信号通路以及肿瘤坏死因子信号通路等，见图5D。 相关靶点调节类风湿关节炎的功能主要富集于转录因子结合(transcription factor binding)，蛋白域特异结合(protein domain specific binding)，近端启动子序列特异性DNA结合(proximal promoter sequence-specific DNA binding)，RNA聚合酶Ⅱ特异性(DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific)，RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合(RNA polymerase Ⅱ proximal promoter sequence-specific DNA binding)，DNA结合转录激活物活性，染色质结合(chromatin binding)等，见图5C。

2.5   二妙散成分-类风湿关节炎异常靶点-通路网络图的构建   文章构建了二妙散成分-类风湿关节炎靶点-通路网络，见图6，并使用CytoScape 3.8.0软件中网络分析插件剖析二妙散治疗类风湿关节炎的网络，其中槲皮素连接度为107，紧密度为0.613 8，介度为0.533 5，因此预测槲皮素为二妙散治疗类风湿关节炎的主要活性成分，其次为汉黄芩素、β-谷甾醇和异紫堇杷明，详见表4。

PTGS2在网络中的连接度为25，介度为0.112 6，紧密度为0.504 2，因此预测PTGS2 为二妙散治疗类风湿关节炎的最主要靶点。JUN，RELA，MAPK1，肿瘤坏死因子，AKT1，RXRA，FOS，PTGS1，CASP3亦为相对重要的靶点，见表5。

2.6   成分-靶点分子对接验证分析结果   文章选取二妙散活性成分中Degree值排名前3的关键药效物质与核心靶点进行分子对接验证发现，关键药效物质与核心靶点结合活性均较好，见表6。将上述对接结果利用Pymol软件绘图，由图可知，槲皮素与 PTGS2在ASN-382，ALA-202，ALA-199处形成氢键，与JUN在LEU-932，MET-929，GLY-856处形成氢键，与RELA在ARG-327，ARG-241，LYS-243处形成氢键；汉黄芩素与PTGS2在ASN-382，ALA-199和HIS-388处形成氢键，与JUN在LEU-932，MET-929，ASP-994处形成氢键，与RELA在GLN-325，ALA-335和HIS-176处形成氢键；β-谷甾醇与PTGS2在THR-212和TRP-387处形成氢键，与JUN在ASP-939，LYS-857和GLU-1015处形成氢键，与RELA在ASN-306，ALA-335和ARG-295处形成氢键，见图7。