一文掌握二代测序NGS

一. RPKM,FPKM,TPM的区别 二. 二代测序中的barcode 三. De Novo sequencing & resequencing 四. depth & coverage 五. 高通量测序技术 六. Sanger测序 七. 三代测序技术 八. 外显子测序 九. small RNA测序 十. SNP、SNV、InDel、CNV、SV 十一. Duplication 十二. Read 十三. Contig/Scaffold 十四. gene fusion，基因融合 十五. Paired-end reads和single reads

先说一个背景： 在运用NGS检测基因表达量时，如果直接用每个基因对应的reads数来统计表达量，常常会导致偏差。偏差主要来源于2个方面： 1) 测序深度； 2) 基因长度。 测序深度越深，基因长度越长，对于随机取样的NGS测序来说，越容易测到该基因的reads，即相应的reads数越多。 因此，基于一定标准，将基因表达量均一化之后再做描述，就能避免上述偏差，获得有意义的结果。 在此，介绍几个均一化之后的表达量的概念：

RPKM: Reads Per Kilobase per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads) FPKM: Fragments Per Kilobase per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments) TPM：Transcripts Per Kilobase per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts) 举一个简单例子： 表1. 各基因reads数。

大家可以清楚地看到，样本C的4个基因read counts数目明显多於其他两个样本，説明其测序深度较高，基因beta的长度的基因alpha的两倍，也使得其read counts在三个样本中都高於alpha。接下来我们要做就是对这个矩阵进行標准化，分別计算RPKM, FPKM和TPM,为了使数值可读性更好，下面的计算中我们用10代表million。

我们先来説説RPKM怎么算。第一步先將测序深度標准化，计算方法很简单，先分別计算出每个样本的总reads数（这里以10为单位），然后將表中数据分別除以总reads数即可，这样就得到了reads per million. 如下表2： 表2. 各基因reads per million。

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